合成生物启发肽γ31-45PvD1++与两性霉素B（AmB）联用对热带念珠菌（Candida tropicalis）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）真菌研究模型的体外活性及协同作用研究

《Current Microbiology》：In Vitro Activity and Synergism of Amphotericin B and the Synthetic Bioinspired Peptide γ31-45PvD1++ Against Fungal Study Models Candida tropicalis and Saccharomyces cerevisiae

　　

摘要专业翻译 近年来，在COVID-19疫情之后，耐药微生物的出现日益增多。这一激增促使全球范围内开展针对新型生物活性分子的研究，尤其是聚焦于涉及抗真菌药物的联合治疗策略。合成抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）已成为应对这一需求的有前景的候选分子。因此，本研究旨在评估合成肽γ31-45PvD1++与两性霉素B（amphotericin B，AmB）联合对热带念珠菌（Candida tropicalis）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的协同治疗效应，以期确定有助于新型药物开发的协同浓度。研究结果表明，合成肽与两性霉素B（AmB）的协同组合可有效诱导热带念珠菌和酿酒酵母的细胞死亡。棋盘法（checkerboard test）检测显示，针对热带念珠菌的协同浓度为AmB 0.048 μM、合成肽γ31-45PvD1++ 0.39 μM；针对酿酒酵母的协同浓度为AmB 0.097 μM、合成肽γ31-45PvD1++ 0.78 μM。暴露于这些协同组合后酵母死亡的潜在作用机制涉及多个过程，包括细胞壁完整性丧失、线粒体功能受损、DNA凝集以及细胞形态和超微结构的损伤。本研究提供的数据将为涉及抗真菌分子联合应用的新型疗法开发做出重要贡献。

论文主体内容解读

一、研究背景与意义

近年来，随着COVID-19疫情的发生，抗生素耐药微生物的出现日益增多，这一趋势促使全球科研界加速探索新型生物活性分子，尤其是涉及抗真菌药物的联合治疗策略。尽管已有包括广谱三唑类和棘白菌素类在内的新型抗真菌药物问世，并用于预防性治疗、经验性治疗和目标性治疗，但与念珠菌血症及其他侵袭性感染相关的死亡率仍居高不下。历史上，白色念珠菌（Candida albicans）一直是主要的致病菌，然而由热带念珠菌（Candida tropicalis）引起的侵袭性感染发生率正在稳步上升。易感人群包括移植受者、HIV/AIDS或癌症患者、接受免疫抑制治疗者、接受全肠外营养者以及早产儿。目前非白色念珠菌感染已占念珠菌血症病例的56.5%，其中光滑念珠菌（33.3%）、热带念珠菌（20.3%）、近平滑念珠菌（1.4%）和克柔念珠菌（1.4%）是最常见的念珠菌种类。

同一药物在不同治疗中的反复使用增加了耐药菌株产生的风险，进而需要不断加大剂量，这可能导致不良副作用。联合治疗策略被认为是应对耐药菌株出现的重要策略，治疗分子的协同效应能够实现剂量降低，从而带来显著优势。然而，天然抗菌肽的发现往往耗时费力，因其产量低、生产成本高，且天然抗菌肽可能存在不利于治疗应用的特性，如易被宿主蛋白酶降解、选择性低、水溶性差、溶血活性、宿主毒性以及盐敏感性等。合成抗菌肽作为克服这些局限性的有前景的替代方案应运而生，其合成基于将分子结构与活性相关联的理性设计。

美国感染病学会推荐两性霉素B（AmB）与联合用药策略用于念珠菌感染的治疗，以应对耐药风险增加的问题。此前已有研究证明，基于γ-core基序延伸合成的肽能够改善抗真菌活性。2019年，Mello等人基于菜豆（Phaseolus vulgaris）防御素（PvD₁）的γ-core基序设计了四种新肽，通过将第37和38位的两个天冬氨酸（Asp）残基替换为两个精氨酸（Arg）残基，使15个氨基酸残基的肽净正电荷增加，得到氨基酸序列为RSGRARRRFRAWATK的肽，命名为γ_31-45PvD₁⁺⁺。研究团队此前已发现该合成肽与AmB的协同组合能够以比商业使用剂量低100倍的AmB浓度杀灭白色念珠菌。本研究的主要目标是评估合成肽γ_31-45PvD₁⁺⁺与AmB联合对热带念珠菌和酿酒酵母的协同治疗效应，以确定可行的协同浓度，为新型药物开发做出贡献。

二、主要技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。菌株方面，热带念珠菌CE017为分离自炼油厂废水的环境分离株，酿酒酵母1038为培养物保藏菌株，二者均来自巴西塞阿拉联邦大学生物学系。主要方法包括：微量肉汤稀释棋盘法（checkerboard assay）评估药物协同作用并计算分数抑制浓度指数（FICI）；SYTOX Green摄取和碘化丙啶（PI）染色监测细胞死亡及质膜通透化；FM4-64探针进行液泡膜分析；MitoTracker Red FM荧光探针和WST-1实验评估线粒体功能及脱氢酶活性；DAPI染色检测染色质凝集；Calcofluor White荧光探针检测细胞壁完整性；扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析细胞表面形态和超微结构。

三、研究结果

合成肽和两性霉素B的效应：研究人员确定了AmB完全（100%）或部分（50%）抑制酵母生长所需的浓度。对于热带念珠菌和酿酒酵母，观察到抑制浓度分别为0.58 μM和1.17 μM以及0.195 μM和0.39 μM。此外，合成肽γ_31-45PvD₁⁺⁺分别在3.12 μM和25 μM浓度下抑制了热带念珠菌和酿酒酵母50%的真菌生长，二者间存在约8倍的差异，表明阳离子抗菌肽的敏感性具有高度物种依赖性。

棋盘法：通过棋盘法检测，研究人员为两种酵母均鉴定出协同条件。热带念珠菌的协同组合为0.048 μM AmB与0.39 μM γ_31-45PvD₁⁺⁺；酿酒酵母的协同组合为0.097 μM AmB与0.78 μM γ_31-45PvD₁⁺⁺。酿酒酵母还观察到若干加性或无关效应的组合。协同浓度被用于后续作用机制和电子显微镜实验。

细胞死亡监测与膜通透化：使用SYTOX Green探针和PI染色评估质膜通透化和坏死途径。在热带念珠菌中，仅在AmB单独处理18小时后观察到两种荧光的标记，协同组合未检测到标记；在酿酒酵母中，所有时间点均未观察到探针标记。这些结果表明两种酵母的协同组合均未涉及质膜通透化或坏死途径的激活。

液泡膜与线粒体功能分析：FM4-64探针分析显示，热带念珠菌各处理组均呈现环状染色模式；而酿酒酵母在协同处理组中观察到更多液泡，提示可能的防御反应。MitoTracker分析表明，两种酵母的协同组合均导致线粒体功能显著改变，而单独使用肽或AmB时线粒体功能与未处理对照相当。WST-1实验显示，协同组合使热带念珠菌脱氢酶活性降低36%，使酿酒酵母降低48%，表明协同处理显著影响细胞代谢活性。

染色质凝集与细胞壁完整性检测：DAPI染色显示，对照细胞呈现强烈且点状的荧光，而协同处理后的两种酵母细胞DAPI染色模式发生改变，表现为点状荧光减少或缺失，提示核改变。Calcofluor White检测显示，对照细胞呈现强烈染色表明细胞壁完整；协同处理后未观察到强烈标记，表明细胞壁完整性丧失，尤其在酿酒酵母中更为明显。

扫描电子显微镜：SEM分析显示，热带念珠菌对照细胞表面无变化，AmB单独处理导致细胞伸长但表面无重大变化，合成肽单独处理与对照相似；而协同组合导致明显粗糙和细胞裂解。酿酒酵母对照细胞呈卵形且无裂纹，单独处理仅造成轻微损伤如皱褶；协同组合则导致严重损伤，包括鳞状和杆状细胞、显著粗糙、明显形态变化和细胞裂解，导致细胞质丢失。透射电子显微镜进一步证实，协同处理下两种酵母的细胞壁、质膜、细胞质组织和细胞器均受到严重损伤。

四、讨论与结论

讨论部分指出，与白色念珠菌不同，热带念珠菌和酿酒酵母在协同条件下均未表现出质膜通透化，表明AmB与γ_31-45PvD₁⁺⁺之间的杀真菌协同作用并非严格依赖于膜孔形成，这些差异可能反映不同酵母物种间膜脂组成、麦角固醇含量与分布以及细胞壁结构的差异。尽管如此，协同处理一致地触发了线粒体功能障碍、染色质损伤、细胞壁完整性丧失以及严重的形态和超微结构改变，支持线粒体损伤和细胞壁失稳是该组合的保守下游事件。

研究人员提出一个合理模型：AmB首先结合麦角固醇并扰动膜组织，可能促进肽的相互作用并诱导细胞内应激反应，导致线粒体功能障碍和细胞壁失稳；或者γ_31-45PvD₁⁺⁺可能首先与细胞壁组分相互作用，间接增加AmB进入富含麦角固醇膜结构域的机会。但研究未直接评估肽是否增强AmB介导的麦角固醇提取或改变甾醇分布，增强甾醇提取应被视为可能的机制而非已证实的机制。

研究强调，通过协同组合实现了AmB有效浓度约四倍的降低，这对减少AmB剂量依赖性肾毒性和输液相关不良反应具有重要意义。然而，这种降低仅在体外条件下确定，不应被解释为体内等效治疗剂量降低的证据，需进一步开展PK/PD指导的剂量探索研究、毒性评估和体内疗效评价。研究也指出，协同处理条件下的细胞毒性尚未评估，未来研究应包含溶血实验和哺乳动物细胞活力分析以确定组合的选择性和安全性。

结论部分指出，本研究证明了生物启发肽γ_31-45PvD₁⁺⁺增强了AmB对热带念珠菌和酿酒酵母的抗真菌活性，产生协同相互作用，影响膜完整性、线粒体功能和核组织。酿酒酵母作为成熟的模式酵母被纳入研究以探究协同处理的细胞和线粒体反应。这些发现为肽-多烯组合策略提供了机制性见解，并强化了抗菌肽作为抗真菌治疗佐剂的潜力。研究数据将为涉及抗真菌分子联合应用的新型疗法开发做出重要贡献。