二甲双胍对非糖尿病老年年龄相关性黄斑变性患者全血转录组影响的探索性研究

《GeroScience》：An exploratory study of the effect of metformin on the whole blood transcriptome of nondiabetic older adults with age-related macular degeneration

摘要 二甲双胍（metformin）因其在降血糖之外的获益而受到越来越多的关注。本研究旨在通过一项随机试验（NCT02684578），识别非糖尿病老年年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）患者接受二甲双胍治疗后全血转录组的变化。研究纳入年龄≥55岁、非糖尿病、因AMD导致地图样萎缩（geographic atrophy）的患者；排除因其他原因使用二甲双胍、肾功能或肝功能减退、或患有其他玻璃体视网膜疾病的患者。受试者被随机分配至二甲双胍组或对照组。二甲双胍组患者接受二甲双胍1000 mg每日两次、持续18个月的治疗方案。所有符合条件的研究对象均被征询是否同意采集血样。研究人员对全血样本进行了宏基因组测序（metagenomic sequencing）并开展差异表达分析。共有15例患者完成血液采集，其中二甲双胍组8例、对照组7例。经多重比较校正后，未发现任何单个基因在两组间达到统计学显著差异。作为次要的、产生假说的分析，经典通路分析（canonical pathway analysis）发现二甲双胍组干扰素α/β信号通路（P=0.003，z score=?2.4）、细胞连接组织（cell junction organization）（P=0.03，z score=?2.2）及上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition）通路（P=0.02，z score=?2.2）下调。二甲双胍可能抑制上游促炎分子并激活抗炎分子。在这项小型随机试验亚研究中，未发现二甲双胍暴露后任何基因发生显著改变。通路富集分析识别出可能与二甲双胍调节“炎症老化”（inflammaging）及其他生物学通路相关的信号，这些发现需在更大规模队列中验证。

二甲双胍对非糖尿病老年年龄相关性黄斑变性患者全血转录组影响的探索性研究：一项随机试验亚研究解读

一、研究背景与目的

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）是老年人视力丧失的主要原因之一，其发病机制与慢性炎症密切相关。二甲双胍（metformin）作为2型糖尿病的一线口服降糖药物，近年来因其降糖之外的潜在抗衰老、抗炎和抗肿瘤效应受到广泛关注。在模式生物中，二甲双胍被证实可延长寿命和健康寿命；在人类研究中，二甲双胍可能延缓认知衰退、降低癌症发生率、减少长新冠（long COVID）发生率，并可能将COVID住院或死亡风险降低一半。二甲双胍的抗衰老效应被认为部分与其减轻“炎症老化”（inflammaging）——即老年人中与发病率和死亡率相关的慢性低度炎症状态——有关。既往研究已在动物模型和细胞培养中识别出二甲双胍相关的转录组改变，但人类转录组数据仍然缺乏。仅有一项单臂探索性研究评估了健康个体接受1周二甲双胍后外周血转录组的变化，发现与免疫反应相关的基因表达发生显著改变。此外，二甲双胍对AMD的潜在保护作用受到关注，但回顾性研究结果存在矛盾。本研究旨在利用随机试验（NCT02684578）的队列，识别非糖尿病老年AMD患者接受18个月二甲双胍治疗后全血转录组的变化。这是首项在非糖尿病老年人中、持续时间超过1年的二甲双胍给药对全局基因表达影响的研究。

二、研究设计与主要发现

本研究作为一项研究二甲双胍对AMD地图样萎缩进展影响的随机试验（METforMIN；ClinicalTrials.gov标识符：NCT02684578）的亚研究开展。研究从美国12个临床中心招募患者，纳入年龄≥55岁、非糖尿病、因非渗出性AMD导致地图样萎缩的患者；排除糖尿病患者、因其他原因使用二甲双胍者、肾功能减退者、Child C级肝硬化者、重度饮酒者、中重度心力衰竭者、其他玻璃体视网膜疾病患者、妊娠者及无法提供知情同意者。受试者按1:1比例、按临床中心分层随机分配至二甲双胍组或对照组。二甲双胍组采用阶梯式递增剂量：第1周500 mg每日一次，第2周500 mg每日两次，此后1000 mg每日两次，总疗程18个月。对照组不接受安慰剂，按标准诊疗管理。所有受试者每6个月随访一次。血液样本在入组时和18个月随访时采集，直接收集至DNA/RNA Shield采血管中，?80°C保存。处理血样和运行分析的人员对治疗分配设盲。宏基因组测序在Illumina NovaSeq 6000平台完成，使用HISAT2比对至人类参考基因组（ENSEMBL GRCh38），使用DESeq2进行差异表达分析，调整基线表达水平，采用Benjamini-Hochberg（BH）校正控制5%假发现率。

研究共筛选93例患者，66例符合条件并随机分组（二甲双胍组32例，对照组34例），其中15例同意采血（二甲双胍组8例，对照组7例）。采血亚组与未采血组基线特征无显著差异；治疗组与对照组基线特征均衡，年龄分别为76.1±9.0岁和79.6±4.7岁（P=0.397）。15例受试者均完成18个月随访。二甲双胍组8例中5例自我报告100%依从，其余报告75–99%依从；3例出现自行缓解的胃肠道不适，无其他相关不良事件。

三、主要结果

（一）差异表达基因分析：调整基线表达后，二甲双胍组与对照组之间共有1100个基因差异表达（BH校正前P<0.05），但经BH校正后无任何基因达到统计学显著。

（二）经典通路分析：作为次要的、产生假说的分析，将上述1100个基因输入IPA经典通路分析，发现二甲双胍组干扰素α/β信号通路（P=0.003，z score=?2.4）、细胞连接组织（P=0.03，z score=?2.2）、上皮间质转化调控（P=0.02，z score=?2.2）及自闭症信号通路（P=0.03，z score=?2.1）下调。其他值得注意的通路包括淋巴样细胞与非淋巴样细胞间免疫调节相互作用（P<0.001，z score=?1.8）、干扰素γ信号（P=0.01，z score=?1.6）、CGAS-STING信号通路（P=0.04，z score=?1.6）及WNT/β-catenin信号（P=0.005，z score=?1.4）的潜在下调。

（三）上游调控分子分析：二甲双胍组显示多种促炎分子的潜在抑制，包括RNY3（P=2.29E-07，z score=?2.6）、STAT1（P=9.25E?05，z score=?3.5）、IFNL1（P=0.000132，z score=?2.8）、IFN BETA家族（P=0.000163，z score=?3.2）、IFNAR（P=0.000409，z score=?2.2）、poly rI:rC-RNA（P=0.000938，z score=?3.4）、C1QA（P=0.00109，z score=?2.2）及IL1B（P=0.00122，z score=?2.5）；同时显示抗炎分子的潜在激活，包括IL1RN（P=2.13E?05，z score=2.3）、IRGM（P=0.000208，z score=2.8）和DUSP11（P=0.000365，z score=2.0）。Scd2在二甲双胍组亦被激活（P=0.000987，z score=2.2）。此外，肿瘤抑制基因STAG2显示潜在激活（P=6.58E?05，z score=2.4），而肿瘤促进基因EZH2（P=0.00021，z score=?2.1）和NONO（P=0.000799，z score=?3.0）显示潜在抑制。β-雌二醇在二甲双胍组被抑制（P=0.000023，z score=?2.0）。

四、讨论与结论

本研究的主要阴性发现是：18个月二甲双胍治疗未在非糖尿病老年AMD患者中产生经多重比较校正后仍显著的单个基因全血转录组改变。次要探索性分析识别出与二甲双胍调节炎症老化相关的潜在信号，包括干扰素信号通路及上游细胞因子的下调、抗炎上游分子的激活，以及AMD发病相关基因、肿瘤抑制基因和癌基因的潜在调控。这些发现与二甲双胍改善炎症老化不良微环境及潜在抗肿瘤作用的文献一致。研究还观察到二甲双胍对上皮间质转化的潜在下调，这可能与AMD视网膜下纤维化的预防有关；对EZH2的潜在抑制可能对AMD具有治疗意义；对细胞连接组织通路的下调可能反映抗增殖或抗纤维化效应，也可能反映衰老相关适应性改变，需谨慎解读。研究存在样本量小、未设盲、未进行细胞类型去卷积、未测量血浆二甲双胍浓度等局限。研究的优势在于：在非糖尿病AMD人群中开展、具有随机对照设计、二甲双胍给药长达18个月、采用宏基因组测序提供无偏见的全局转录组评估。研究结论为：该小型随机试验亚研究未检测到长期二甲双胍治疗在非糖尿病老年AMD患者中产生统计学稳健的全血转录组改变；次要探索性分析识别出可能与炎症通路、脂质生物学及AMD和肿瘤相关基因调控一致的信号，但这些观察属推测性，不应过度解读为二甲双胍效应的证据，需在更大规模、充分把握度的队列中验证。