CCKBR信号通路调控人类定型内胚层特化与胰腺谱系分化

《Diabetologia》：CCKBR signalling controls human definitive endoderm specification and pancreatic lineage differentiation

　　

目的/假设：激素分泌型内分泌细胞产生的旁分泌信号可能影响胰腺发育，但这种反馈调控仍不清楚。研究人员探讨了胃泌素（gastrin，GAST）、胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）及其受体胆囊收缩素B受体（cholecystokinin B receptor，CCKBR）在人类胰腺发育中的作用。方法：研究人员将人类诱导多能干细胞（human iPSC）逐步分化为定型内胚层（definitive endoderm，DE）及胰腺内分泌谱系；利用CRISPR/Cas9构建CCKBR敲除iPSC系；通过 bulk 与单细胞RNA测序（scRNA-seq）、生化检测、流式细胞术（FACS）和共聚焦显微镜进行分析。结果：CCKBR表达在DE形成期达峰，随后下降，在胰腺祖细胞（pancreatic progenitor，PP）中仍可检测，而在内分泌谱系中基本缺失；GAST与CCK仅在PP和内分泌谱系形成期短暂表达。药理激活/抑制及基因敲除均表明CCKBR信号参与DE形成；CCKBR缺失触发外胚层与中胚层相关转录程序，削弱胰腺谱系特化。持续CCKBR激活抑制内分泌发生，促进上皮结构形成及导管样细胞出现。结论/解释：GAST/CCK–CCKBR轴在人类内胚层与胰腺发育中具有功能重要性，可调控胚层形成及导管与内分泌命运决定，对优化胰腺分化方案和相关疾病研究具有启示。

研究背景方面，替代丢失的胰岛素生成β细胞是治疗1型糖尿病的重要策略，人尸源胰岛受供体不足、免疫排斥和分离损伤限制，人多能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）来源胰岛细胞成为有前景的替代方案。现有干细胞向胰岛细胞分化方案多模仿胚胎发育：定型内胚层（DE）先后形成前肠祖细胞、胰腺祖细胞（PP）、内分泌祖细胞（EP，以NEUROG3/NGN3为标志），最终分化为胰岛素阳性β细胞、胰高血糖素阳性α细胞、生长抑素阳性δ细胞等。然而干细胞来源胰岛体内定植和功能成熟延迟，说明对人类胰岛形成机制理解仍不足。已有研究提示，胰岛素受体信号可反馈调节内分泌细胞分化，但胃泌素（GAST）、胆囊收缩素（CCK）等发育期短暂表达的胰腺激素是否通过受体轴影响内分泌与外分泌平衡仍不清楚。GAST与CCK共享C端α酰胺化五肽，主要通过CCKAR与CCKBR两类G蛋白偶联受体（GPCR）发挥作用；成年小鼠中GAST可促进外分泌细胞重编程为β细胞，CCK类似物可强烈刺激外分泌分泌并诱发胰腺炎，但GAST/CCK–CCKBR轴在人类胰腺发育中的功能此前未知。因此，研究人员以人类iPSC体外分化系统结合药理与遗传扰动，明确该轴在内胚层与胰腺谱系形成中的作用。

本研究论文发表于《Diabetologia》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用人类iPSC来源细胞模型，经CRISPR/Cas9构建CCKBR敲除报告细胞系；采用六阶段3D类胰岛（SC-islet）分化体系；通过bulk RNA-seq与 droplet-based scRNA-seq刻画转录状态；以流式细胞术定量FOXA2/SOX17、PDX1/NKX6-1、NGN3等谱系标志物；以共聚焦免疫染色验证GAST、CCK、CK7、Ezrin等蛋白表达；并以CCKBR激动剂GAST、非硫酸化CCK及选择性拮抗剂YM022进行阶段特异性药理干预。

研究结果方面，GAST、CCK和CCKBR在早期人类内胚层和胰腺发育中呈现不同动态表达模式。研究人员整合早期胚胎参考数据集发现，CCKBR在DE与卵黄囊内胚层形成期高表达，GAST多见于下胚层与滋养外胚层，CCK见于八细胞期及轴中胚层；人胎胰7至20 PCW数据中CCKBR广泛表达于多能祖细胞、导管和腺泡区，GAST在所用胎胰数据集中未检出，CCK限于特定PP、EP和前α细胞。体外分化中CCKBR在DE与后前肠期高表达，PP阶段下降；GAST与CCK在PP2和EP阶段出现，激素分泌阶段回落，并与α及多激素细胞共定位。结论是该轴配体与受体在时间和空间上错位表达，为旁分泌调控提供可能。

CCKBR功能缺失损害人类DE分化。研究人员用GAST激活CCKBR可增加FOXA2⁺/SOX17⁺ DE细胞比例，用YM022抑制则降低该比例；在前肠阶段抑制效应更明显。CRISPR构建的CCKBR^KO/KO与CCKBR^KO/Δ12 iPSC中，DE标志细胞减少、中内胚层前体增多，并顺次导致PP1（PDX1⁺）和PP2（PDX1⁺/NKX6-1⁺）形成显著下降。结论是CCKBR功能对DE特化与后续胰腺祖细胞供给十分关键。

CCKBR缺失促进非DE分化程序。S1.3期bulk RNA-seq显示，CCKBR靶向克隆与野生型明显分离；下调基因涉及细胞分化、细胞外基质/细胞黏附、分泌与激素响应，上调基因涉及中胚层与外胚层组织形成，包括血管内皮、心肌/平滑肌、神经外胚层/中枢神经样程序，同时出现肠样、纤毛气道样、肝样代谢等非胰腺内胚层特征，HOX与前后轴内胚层模式基因也受影响。结论是CCKBR缺失使细胞偏离DE，转向中胚层、外胚层及其他内胚层上皮身份。

持续CCKBR激活损害内分泌谱系分化。从S1开始用GAST或非硫酸化CCK处理，PP2细胞、NGN3⁺ EP、NKX2-2⁺细胞及成熟激素阳性细胞均减少，SC-β细胞比例下降；从S4.1即PP2期开始处理仍削弱NGN3与激素细胞形成，但程度较轻。结论是持续CCKBR信号直接抑制内分泌诱导，且不只通过减少祖细胞数量起作用。

持续CCKBR信号驱动非内分泌细胞命运程序。scRNA-seq在S5.4将细胞分为胰腺内分泌、成纤维样和非内分泌胰腺上皮三大类；非内分泌上皮进一步出现导管/外分泌样亚群，高表达SLC4A4、SOX9、CA2、CA12、ONECUT1、ONECUT2、AGR2、MUC13、TFF1、TFF2等，但不高表达CFTR、KRT19、CPA1、AMY2A等成熟导管或腺泡标志。免疫染色显示Ezrin极性分布与CK7阳性扩张上皮。结论是长期CCKBR激活把PP和上皮细胞推向部分导管样、外分泌样身份，而非完全成熟导管细胞。

讨论部分总结，研究人员提出CCKBR双相作用模型：胚层特化期促进DE形成与前后轴模式化；胰腺分化期持续激活则抑制内分泌程序，使PP偏向导管/外分泌样轨迹。药理激活与基因敲除虽都降低终末内分泌细胞产量，但机制不同：前者直接压制内分泌分化，后者通过早期DE与祖细胞供给受损间接减少内分泌输出。体外DE阶段虽未检测到GAST/CCK，但CCKBR缺失仍破坏DE，说明可能存在培养基来源、内源性或组成型活性配体无关信号。GAST/CCK主要由前α和多激素细胞表达，提示新兴内分泌细胞通过旁分泌反馈影响邻近双潜能祖细胞的导管—内分泌抉择，类似Notch侧向抑制但并非同一机制。持续激活所产生的导管样细胞只具部分导管程序，若在导管定向分化中或人体外器官模型中增强，可能有助于研究导管可塑性、胰腺炎与胰腺导管腺癌。

结论部分翻译如下：本研究证明CCKBR信号在两个不同发育窗口具有功能必要性，先是DE形成，后是胰腺谱系命运决定，并提供GAST/CCK–CCKBR轴参与人类内胚层与胰腺发育的首个功能证据。该轴下游信号通路仍需进一步研究。上述结果已可帮助优化分化方案以定向获得特定胰腺谱系。除干细胞分化外，鉴于糖尿病中GAST与CCK可在成年胰腺重新表达，本研究也有助于理解这些激素在胰岛再生中的作用。最后，该发现还可扩展到胰腺导管腺癌，因为CCK已被认为参与内分泌—外分泌对话及外分泌肿瘤进展。