印度Manipur山溪淡水蟹源Paragonimus westermani囊蚴的形态学与分子鉴定及系统发育分析

《Journal of Parasitic Diseases》：Morphological and molecular characterization of Paragonimus westermani metacercariae isolated from crabs of mountain streams of Manipur, India

　　

并殖吸虫病（paragonimiasis）在印度东北部各邦呈地方性流行。本研究旨在从印度Manipur两个地方性流行区Moreh和Churachandpur采集的淡水蟹中分离Paragonimus westermani囊蚴（metacercariae），并通过囊蚴的形态学和分子鉴定确定物种。共采集300只淡水蟹，其中140只来自Churachandpur、160只来自Moreh，分别鉴定为Maydelliathelphusa lugubris和Alcomon superciliosum。采用人工消化、分级过滤和沉淀法制备蟹提取物，并在体视解剖显微镜下观察分离类P. westermani囊蚴。共分离45只类P. westermani囊蚴，其中20只来自Churachandpur、25只来自Moreh，并分别分组用于形态学和分子研究。每组4只囊蚴保存于80%酒精中用于DNA提取，其余囊蚴固定于10%福尔马林用于形态学研究。囊蚴形态学鉴定在体视变焦解剖显微镜下进行。为进行分子鉴定，从单个囊蚴提取基因组DNA，并针对内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）和线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1，cox₁）基因进行PCR扩增和测序，随后进行系统发育分析。标本的形态学鉴定和分子分析确认其身份为P. westermani。基于ITS2和cox₁序列的系统发育分析揭示两个明显分支，其中ITS2显示与印度其他东北部各邦分离株密切相似。

研究背景与问题：并殖吸虫病（paragonimiasis，由并殖吸虫属吸虫引起的食源性寄生虫病）在南美洲、非洲和亚洲部分地区流行，在印度东北部各邦呈地方性流行。该病病原为Paragonimus属吸虫，生活史需要终宿主和两个中间宿主，淡水螺为第一中间宿主，淡水蟹和淡水螯虾为第二中间宿主（second intermediate host，寄生虫生活史中幼虫发育的宿主），犬科、猫科动物及人可为终宿主；人通常因食用含感染性囊蚴（metacercariae，吸虫感染性幼虫阶段）的生或未煮熟蟹、螯虾、猪肉或野猪肉而感染。肺部最常受累，腹部、皮肤和脑部受累亦非少见。Manipur首例肺并殖吸虫病由Singh等（1993）描述，但未确认Paragonimus物种；此后印度东北部被明确为并殖吸虫病地方性流行区，Manipur患病率为2%—36%，Arunachal Pradesh为52%，Nagaland为50%。P. heterotremus曾被认为是印度东北部常见致病种，Singh等（2015）报道了由P. westermani引起的肺并殖吸虫病病例。仅依据囊蚴、成虫和虫卵形态难以确认物种，PCR和DNA测序等分子检测更可靠；cox₁和ITS2分别为较好的种内和种间标记。因此，研究人员对Manipur的类P. westermani囊蚴开展ITS2和cox₁分子鉴定及系统发育关系分析。

研究人员开展的研究与总体结论：研究人员于2020年7月至10月在Manipur的Churachandpur和Moreh山溪采集300只淡水蟹，其中Churachandpur的140只为M. lugubris，Moreh的160只为A. superciliosum；经人工消化、分级过滤和沉淀分离囊蚴，共获得45只类P. westermani囊蚴。形态学与分子分析确认其为P. westermani，并获得16条新序列提交GenBank；基于ITS2和cox₁的系统发育分析显示两个明显分支，ITS2序列与印度东北部其他邦分离株高度相似。研究确认A. superciliosum和M. lugubris为自然允许的甲壳类第二中间宿主，补充了Manipur P. westermani的分子证据和系统发育关系，并提示应加强公共卫生教育以降低感染风险。

关键技术与方法（不超过250字）：样本来源为2020年7月至10月印度Manipur的Churachandpur和Moreh山溪淡水蟹：Churachandpur 140只M. lugubris，Moreh 160只A. superciliosum。研究人员以人工消化、分级过滤和沉淀法分离囊蚴，在体视显微镜下进行形态学观察；从单个囊蚴提取DNA，PCR扩增ITS2和cox₁并测序，经BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比对搜索工具）比对和GenBank登记；用Clustal W进行多序列比对，MEGA X以最大似然法（maximum likelihood）构建系统发育树，1000次bootstrap重复，并以Kimura二参数（K2P）模型计算核苷酸替换。

研究结果：蟹种鉴定与囊蚴分离：通过采集和显微镜检查，300只蟹分别鉴定为M. lugubris和A. superciliosum，共分离45只类P. westermani囊蚴；A. superciliosum同时携带P. westermani和P. heterotremus，M. lugubris仅携带P. westermani；P. heterotremus因超出研究范围未进一步处理。囊蚴形态学特征：通过体视显微镜观察，囊蚴呈椭圆形，具深棕色“I”形排泄囊并延伸至肠分叉；囊长径450—550 μm、横径420—460 μm，平均500×440 μm；具两层囊壁，内壁较厚，厚29.5 μm；清晰卷曲肠管位于排泄囊两侧；口吸盘具stylet且略小于腹吸盘；多数囊蚴体内散布粉红色颗粒；上述特征符合P. westermani囊蚴。ITS2和cox₁测序与序列登记：通过PCR扩增、测序和BLAST分析，囊蚴鉴定为P. westermani，16条新序列提交GenBank，cox₁和ITS2各8条。核苷酸替换模式：通过MEGA X最大复合似然估计，获得ITS2和cox₁的核苷酸频率、转换/颠换率比及转换/颠换偏倚。系统发育分析：基于cox₁和ITS2构建的最大似然树均显示两个明显分支，bootstrap支持>95%；cox₁树中本研究8条序列与印度及其他亚洲国家的P. westermani聚为一支，P. miyazakii、P. harinasutai和P. siamensis为近缘但独立物种；ITS2树中P. westermani形成独立大分支并含两个亚支，本研究序列与印度早期分离株及泰国分离株紧密聚类，另一亚支包含印度、越南、中国和俄罗斯分离株，Clade II包含P. heterotremus、P. skrijabini和P. proliferus。

讨论总结与结论翻译：讨论指出，肺并殖吸虫病是印度东北部新兴公共卫生问题；此前该地区仅将P. heterotremus视为致病种，Singh等（2015）从Manipur患者痰液虫卵的分子分析中鉴定出P. westermani；同年Moreh附近A. superciliosum中形态鉴定为P. westermani的囊蚴尚未进行充分分子鉴定和系统发育分析。本研究确认Moreh的A. superciliosum和Churachandpur的M. lugubris为自然甲壳类第二中间宿主；作者指出P. westermani流行可能与蟹宿主内特定微环境选择有关，蟹宿主内微环境变化利于单一物种或种复合体不同形式囊蚴在同一宿主中共存。ITS2或cox₁序列分析不仅鉴定P. westermani，还显示其与印度东北部菌株相似而与其他国家不同，证明这些标记在Paragonimus鉴定中的重要性。Manipur P. westermani的cox₁序列与其他东北部各邦P. westermani聚类，显示印度分离株的独特谱系；其ITS2序列与Assam、Arunachal Pradesh和Meghalaya描述的P. westermani Type 1一致，提示相同P. westermani复合体成员在印度东北部循环。讨论还提到ITS2基因在群体和物种间的分化可受基因转换、遗传漂变、不等交换率、重复序列相对数量和大小、迁移及位点数影响；线粒体DNA在进化群体遗传分析中应用渐增，cox₁在个体间种内变异较少或无；Zhou等（2021）比较中国金华P. westermani分离株并提出cox₁可作为鉴定并殖吸虫病感染来源的合适标记；PCR为单管反应、可靠、灵敏度和特异性高、可在1小时内获得结果，若具备P. westermani种特异引物，可用于实验室检测，有助于准确诊断和积极管理并殖吸虫病，从而降低东北部发病率和死亡率。本研究仅关注P. westermani的关联、分离和鉴定，其他物种仍需进一步研究。结论翻译：本研究表明P. westermani至少在Manipur的Churachandpur和Moreh两个地理地点流行，A. superciliosum和M. lugubris为自然允许的甲壳类第二中间宿主。P. westermani在人类并殖吸虫病中的作用需通过对Paragonimus虫卵阳性临床病例的虫卵进行PCR和DNA测序进一步研究。建议在更多地方性流行区开展类似研究并广泛采样不同蟹种，以了解P. westermani和蟹宿主物种的分布范围。应教育公众，尤其是Moreh和Churachandpur居民，不要食用生或未煮熟的淡水蟹，以避免感染并殖吸虫病。