中国三家先天性无虹膜家系的PAX6基因变异谱系：基因型–表型关联与分子诊断策略研究

《Frontiers in Medicine》：Diverse PAX6 variants in three Chinese families with congenital aniridia: genotype–phenotype correlations and diagnostic implications

　　

摘要专业翻译 目的： 报告三个携带不同类型PAX6基因变异的先天性无虹膜家系，分析其遗传学特征及基因型–表型关联，并探讨多技术联合检测策略在无虹膜分子诊断中的应用价值。 材料与方法： 对三个无虹膜家系中的先证者及其家庭成员进行系统性眼科检查。采用高分辨率染色体核型分析、微阵列比较基因组杂交（array comparative genomic hybridization, aCGH）、全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）、Sanger测序及实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）等多种技术进行遗传学检测。依据美国医学遗传学与基因组学学会/临床基因组资源（American College of Medical Genetics and Genomics/Clinical Genome Resource, ACMG/ClinGen）指南评估变异致病性。 结果： 在各自家系中鉴定出三个致病性或可能致病性变异：家系1携带11p13杂合缺失，arr[GRCh37] 11p13(31037165_34227327)×1（约3.19 Mb），缺失区域涵盖PAX6、WT1及其他多个基因，该变异为新发（de novo）；家系2携带PAX6杂合移码变异c.1234del（p.Ser412ProfsTer127）（基于当前MANE Select转录本NM_001368894.2），遗传自母亲；家系3携带新发11p14.1p13大片段缺失，seq[GRCh37] del(11)(p14.1p13) NC_000011.9:g.30352495_33350179del（约2.998 Mb），缺失区域同样涵盖PAX6、WT1及其他基因。依据ACMG/ClinGen标准，两个拷贝数变异（copy number variant, CNV）被分类为致病性，移码变异被分类为可能致病性。 结论： 本研究报道了三种不同类型的致病性或可能致病性PAX6变异，丰富了无虹膜的变异谱系。aCGH、WES与Sanger测序的联合应用可显著提高无虹膜的分子诊断率。家系1和家系3的缺失区域均涵盖WT1基因，符合WAGR综合征的分子诊断标准。值得注意的是，家系3的先证者在就诊前已被诊断为肾母细胞瘤（Wilms tumor），凸显了精准遗传诊断对临床管理和遗传咨询的重要性。

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一、研究背景与问题

先天性无虹膜（congenital aniridia，OMIM #106210）是一种罕见的遗传性眼病，以虹膜发育不全或缺如为主要特征，患病率约为1/64,000至1/96,000。该疾病并非孤立的虹膜异常，而是一种累及全眼的泛眼部疾病，常伴有角膜病变（无虹膜相关性角膜病，aniridia-associated keratopathy, AKP）、白内障、青光眼、黄斑中心凹发育不全及眼球震颤，严重损害视功能。PAX6基因（paired box gene 6，OMIM *607108）定位于染色体11p13，编码高度保守的配对盒转录因子，是眼发育的主调控基因，在晶状体、角膜、视网膜和虹膜的发育中发挥不可或缺的作用。PAX6基因包含14个外显子（含选择性剪接外显子5a），编码含配对盒结构域、同源异型结构域及脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸（proline-serine-threonine, PST）反式激活结构域的蛋白。PAX6单倍剂量不足是先天性无虹膜的主要致病机制，约80%–90%的患者可检出PAX6杂合功能丧失性变异。

目前已报道超过500种致病性PAX6变异，涵盖无义变异、移码变异、剪接位点变异、错义变异及拷贝数变异（copy number variant, CNV）。其中CNV——包括基因内缺失、全基因缺失及涵盖PAX6调控区的远端缺失——约占所有致病性变异的10%–20%。当11p13缺失区域同时涵盖WT1基因时，患者可能出现WAGR综合征（肾母细胞瘤、无虹膜、泌尿生殖系统异常和智力障碍；OMIM #194072），具有较高的肾母细胞瘤发生风险。

当前无虹膜的分子诊断方法多样，包括Sanger测序、多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）、染色体微阵列及下一代测序（next-generation sequencing, NGS），不同方法对不同变异类型的检测能力各异。然而，临床诊疗仍面临多重挑战：表型异质性可延误临床识别；变异类型多样导致单一检测技术无法覆盖全部变异类型；当缺失累及WT1时，早期分子诊断对启动肾母细胞瘤监测至关重要；家族性变异的精准鉴定是生殖咨询、携带者检测和产前诊断的基础。在中国人群中系统报道并比较多种变异类型的研究仍较有限，亟需多技术联合检测策略的探索。

二、研究内容与结论

本研究纳入三个先天性无虹膜家系，共11名家庭成员（3名先证者、7名其他家庭成员及1名接受产前诊断的胎儿），通过高分辨率染色体核型分析、aCGH、WES、Sanger测序及qPCR等多技术联合检测，在三个家系中分别鉴定出不同类型的致病性或可能致病性PAX6变异：家系1为新发约3.19 Mb的11p13杂合缺失；家系2为母源遗传的PAX6移码变异c.1234del（p.Ser412ProfsTer127）；家系3为新发约2.998 Mb的11p14.1p13大片段缺失。两个CNV依据ACMG/ClinGen标准被分类为致病性，移码变异被分类为可能致病性。该研究丰富了PAX6相关无虹膜的变异谱系，并证实aCGH、WES与Sanger测序的联合应用可显著提高无虹膜的分子诊断率。家系1和家系3的缺失区域均涵盖WT1基因，符合WAGR综合征分子诊断标准，其中家系3先证者已被诊断为肾母细胞瘤，凸显了精准遗传诊断对临床管理和遗传咨询的重要价值。

三、关键技术方法

研究人员采用多技术联合检测策略：对三个家系共11名成员（含1名胎儿）采集外周血及羊水样本。主要技术包括高分辨率染色体核型分析（550–700条带分辨率）、微阵列比较基因组杂交（aCGH，Affymetrix CytoScan 750K Array，分辨率200 kb）、全外显子组测序（WES，Illumina NovaSeq 6000平台，IDT xGen Exome Research Panel v2.0捕获，PE150测序策略）、Sanger测序（ABI 3730xl）及实时荧光定量PCR（qPCR）。WES数据采用ML-ExonCNV v1.0.0软件进行基于读深的CNV检测。变异致病性依据ACMG/ClinGen指南评估。

四、研究结果

家系1：11p13杂合缺失的检出。 先证者（1.3）为女性，表现为双眼视力差，裂隙灯检查示双眼虹膜缺如伴点状后粘连及眼球震颤。高分辨率染色体核型分析示46,XX，未见明显异常。aCGH分析检出约3.19 Mb的11p13杂合缺失，arr[GRCh37] 11p13(31037165_34227327)×1，缺失区域涵盖PAX6、WT1、ELP4、RCN1、CCDC73等多个基因。因缺失区域同时涵盖PAX6和WT1，先证者符合WAGR综合征分子诊断标准，该缺失被分类为致病性。qPCR验证显示先证者PAX6外显子2、7、14相对拷贝数约为1.0，父母及妹妹拷贝数正常，确认该缺失为新发变异。

家系2：PAX6移码变异（NM_001368894.2:c.1234del）的检出。 先证者（2.3）为女性，自幼双眼视力差伴畏光及眼球震颤，裂隙灯检查示双眼虹膜缺如伴晶状体前囊下点状混浊，其母亲（2.2）亦表现双眼虹膜发育不全，符合常染色体显性遗传模式。WES检出PAX6外显子14杂合单碱基缺失，基于MANE Select转录本（NM_001368894.2）描述为c.1234del（p.Ser412ProfsTer127）。因移码位于末端编码外显子，预测可逃逸无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD），编码C端延长的537个氨基酸蛋白（野生型为436个氨基酸）。Sanger测序验证先证者及其母亲携带该杂合变异，父亲未携带，确认母源遗传及共分离。产前诊断显示胎儿（2.4）未携带该变异。该变异未见于gnomAD及ClinVar等公共数据库，属新变异。依据ACMG标准，结合PVS1_Strong（4分）+PM2_Supporting（1分）+PP3（1分）+PP4（1分）共7分，该变异被分类为可能致病性。

家系3：11p14.1p13杂合缺失的检出。 先证者（3.3）为男性，出生时即发现双眼虹膜缺如，伴眼球震颤及畏光，OCT证实左眼黄斑中心凹发育不全，眼底呈轻度豹纹状外观。先证者同时表现轻度智力障碍，且在就诊前已被诊断为肾母细胞瘤。染色体核型分析示46,XY，未见异常。基于WES读深的CNV分析（ML-ExonCNV v1.0.0）检出约2.998 Mb的11p14.1p13杂合缺失，seq[GRCh37] del(11)(p14.1p13) NC_000011.9:g.30352495_33350179del，缺失区域完全涵盖PAX6（外显子1–14）和WT1（外显子1–10）及DCDC1、DNAJC24、ELP4、RCN1等基因。因缺失同时涵盖PAX6和WT1，符合WAGR综合征分子诊断标准，被分类为致病性。qPCR验证确认先证者为单拷贝缺失，父母拷贝数正常，证实该缺失为新发变异。

五、讨论与结论

本研究在单一诊断框架内直接比较了aCGH与WES读深两种CNV检测方法，两种方法均能有效检出大片段缺失，而WES还能额外检出单碱基移码变异，支持在专用芯片平台不可用时将WES-based CNV分析作为灵活替代方案。家系2的移码变异基于当前MANE Select转录本进行注释，为该C端延长等位基因提供了更新的参考描述。家系3提供了重要的临床教训：肾母细胞瘤的诊断先于潜在11p14.1p13缺失的分子确认，强调无虹膜的分子诊断可追溯性地确立肿瘤风险，应尽早进行，包括看似散发的病例。家系2的产前诊断展示了鉴定家族性变异的直接生殖应用价值。

三个家系的遗传方式不同，需制定个体化的遗传咨询策略。家系1和家系3为新发变异，先证者后代有50%的患病风险，父母再发风险较低（需排除性腺嵌合）。家系2为常染色体显性遗传（母源），携带者后代有50%的患病风险。对于家系1和家系3，鉴于WAGR综合征相关的肿瘤风险，建议多学科管理，包括眼科、肾脏科、肿瘤科及神经发育科的定期随访。

研究结论： 通过多技术联合检测，在三个先天性无虹膜家系中鉴定出三种不同类型的致病性或可能致病性PAX6变异：家系1为新发约3.19 Mb的11p13杂合缺失，家系2为母源遗传的移码变异c.1234del（p.Ser412ProfsTer127；NM_001368894.2），家系3为新发约2.998 Mb的11p14.1p13大片段缺失。三个变异均损害PAX6功能，两个缺失通过单倍剂量不足机制，移码变异通过破坏PST反式激活结构域机制。家系1和家系3的缺失区域均涵盖WT1基因，符合WAGR综合征诊断标准，其中家系3先证者已被诊断为肾母细胞瘤。本研究丰富了PAX6相关无虹膜的变异谱系，并强调了aCGH、WES和Sanger测序联合应用在无虹膜精准诊断和遗传咨询中的重要价值。