《Frontiers in Molecular Biosciences》：Breath molecular feature profiling with machine learning for noninvasive diagnosis of gout: a single-center case-control study
编辑推荐：
目的：痛风是一种嘌呤代谢紊乱性疾病，全球患病率不断上升，目前依据美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR）标准进行诊断，但互补性的无创工具仍然有限。本研究评估了呼气分子特征分析能否区分确诊的痛风患者与健康对照者。
方法：在这项初步的单中心研究中，从
目的：痛风是一种嘌呤代谢紊乱性疾病，全球患病率不断上升，目前依据美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EULAR）标准进行诊断，但互补性的无创工具仍然有限。本研究评估了呼气分子特征分析能否区分确诊的痛风患者与健康对照者。
方法：在这项初步的单中心研究中，从201名参与者（99名确诊痛风患者和102名健康对照者）中收集了呼气样本。采用电喷雾萃取电离质谱（EESI-MS）对呼气分子特征进行分析。应用随机森林机器学习构建分类模型并识别具有鉴别能力的呼气分子特征。同时比较了两组间的舌苔特征和临床特征。
结果：通过EESI-MS对呼出气进行分析，鉴定出12个差异呼气分子特征作为候选的痛风生物标志物。假定的尿酸盐二聚体显著上调，而其他11种离子则下调。基于呼气分子特征的BreathGOUT模型通过5折分层交叉验证实现了0.999（95%置信区间CI 0.997–1.000）的曲线下面积（AUC），准确度、敏感度和特异度均达到0.990。单模态分解分析证实，BreathGOUT保持了0.999的AUC，表明呼气分子特征提供了与单独由临床特征捕获的信息互补的鉴别信息。三模态整合模型BreathGOUT-Plus也产生了0.999的AUC；尽管它并未进一步提高诊断性能，但它增强了对短期混杂影响的稳健性。
结论：在此病例对照环境中，对呼气分子特征的机器学习分析可靠地区分了已确诊的痛风状态与健康状态。该模型表现出卓越的区分能力，并鉴定了候选生物标志物。多模态融合提高了临床稳健性以及中西医维度的可解释性。这一概念验证支持未来开展纳入无症状高尿酸血症、首次发作关节炎及其他关节炎的多中心研究，以评估其更广泛的临床应用潜力。
研究背景、现存问题与研究动机
痛风是一种由嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄障碍引起的高流行性代谢性风湿疾病，其核心病理表现为高尿酸血症及随后的单钠尿酸盐（MSU）晶体沉积，从而触发强烈的自身炎症反应。临床上，痛风以反复发作的急性关节炎、痛风石、关节畸形和肾功能损害为特征，常伴随代谢综合征及心脑血管并发症，给患者健康带来沉重负担。受生活方式改变、肥胖及人口老龄化驱动，全球痛风负担持续上升。2020年全球约有5580万例患者，较1990年增长22.5%，预计到2050年将达9580万例。在中国，成人高尿酸血症患病率为13.3%，痛风患病率为1.1%，受影响人数超过9000万，且呈现年轻化趋势。现有证据表明，痛风不仅仅是高尿酸血症的直接后果，其发病机制涉及尿酸处理紊乱、炎症通路过度激活以及与代谢综合征的密切联系。
当前，痛风的诊断和管理主要依赖ACR/EULAR标准，辅以血清尿酸检测、影像学检查和滑液晶体鉴定，这些方法具有高特异性和临床权威性。然而，该诊断框架仍不理想。血清尿酸水平易受多种因素干扰，可能在早期代谢异常患者中出现假阴性结果，而侵入性操作不适合大规模筛查或纵向随访。在此背景下，对尿液和呼出气中挥发性有机化合物（VOCs）进行无创代谢组学评估成为一种有吸引力的替代方案，因为它能够灵敏地反映处于痛风病理生物学核心的嘌呤代谢紊乱和炎症应激。实验研究表明，VOCs可能通过促进炎症和抑制肾小管尿酸排泄参与痛风进展。这种方法无创、可重复，且适用于早期预警和定量监测，从而解决了传统诊断方法的若干关键局限性。然而，VOC生物标志物的疾病特异性尚不充分，缺乏标准化分析流程和诊断阈值，因此基于VOC的检测目前只能作为辅助筛查工具，而非替代金标准诊断标准。因此，传统方法对于确诊仍然必不可少，而VOC分析代表了一种重要的补充策略，两者的整合可能为痛风的全病程管理提供更精确的框架。
呼气VOCs谱分析已越来越多地应用于炎症性疾病。在炎症性肠病中，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测的七种呼气VOCs组合在连续验证阶段区分患者与非炎症性肠病对照的AUC分别达到1.000、0.978和0.966，且部分标志物与疾病活动度相关。哮喘中的呼吸组学研究同样证实，呼出气VOCs对潜在气道炎症敏感，可区分患者与健康对照并支持表型分层。在肝胆疾病中，一组20种呼气VOCs区分原发性硬化性胆管炎与炎症性肠病对照的AUC为0.84，甚至在碱性磷酸酶正常时也能检出早期病例。这些发现共同表明，慢性炎症——无论是黏膜、气道还是胆道炎症——都会产生可通过无创呼气采样获取的特征性挥发性代谢产物模式。因此，从机制上讲，这一范式很可能扩展到由MSU晶体沉积和嘌呤代谢失调驱动的痛风。将呼气VOCs产生与炎症期间的代谢扰动和氧化应激联系起来的机制研究支持了以下观点：呼气VOCs有潜力反映嘌呤代谢失调和炎症活动，使其成为无创痛风诊断的有前景靶点。值得注意的是，这些研究均采用GC-MS进行，该方法对挥发性化合物高度敏感和特异。环境电离技术如电喷雾萃取电离质谱（EESI-MS）则提供互补覆盖范围，将呼气分析扩展到半挥发性和非挥发性代谢物，从而为相同的病理生理过程提供更宽的分子窗口。
基于上述更广泛的概念，本研究评估了呼气分子特征在痛风中的诊断潜力，同时关注分析平台的选择和多模态数据整合的价值。EESI-MS是一种新开发的环境电离技术，能够在不进行样品预处理的情况下快速、无创地检测痕量分子特征，并为识别痛风相关代谢特征提供强大的抗干扰能力。与传统平台如GC-MS和液相色谱-质谱联用（LC-MS）相比，EESI-MS支持原位、实时的呼气分析，覆盖更广的候选生物标志物范围，特别适合大规模筛查和动态监测；但其在精确定性和定量表征方面的性能仍有待提高。除了分析平台的选择，痛风本身的临床复杂性也促使多维诊断方法的发展。痛风相关的病理生理学涵盖代谢失调、流行病学-临床特征和中医证候模式。呼气分子特征分析捕获代谢维度；临床特征捕获流行病学维度；舌苔特征捕获中医证候维度，后者与痛风发病和亚型分类密切相关。因此，在本研究中，研究人员开发了纯质谱分类模型以及整合临床和舌部特征的多模态模型，并在概念验证的病例对照环境中系统比较了它们的区分性能。目的是评估多源数据整合是否能增强呼气分子特征分析在区分确诊痛风患者与健康对照者方面的稳健性，为未来的临床验证奠定基础。
主要假设和性能指标：研究人员假设，对呼出气分子特征的机器学习分析能够在此病例对照样本中区分确诊的痛风患者与健康对照者。预设的主要性能指标是通过5折分层交叉验证及合并的折外预测评估的BreathGOUT模型的受试者工作特征曲线下面积（AUC）。次要性能指标包括精确率-召回率曲线下面积（AUPRC）、准确度、敏感度和特异度；三模态BreathGOUT-Plus模型作为次要分析进行评估，以评估多源数据整合的增量价值。
研究方法与技术路线
研究人员开展了一项单中心病例对照研究，于2025年12月至2026年3月在江西中医药大学附属医院招募了共计201名参与者，其中包括102名健康对照者和99名确诊痛风患者。主要关键技术方法如下：1）呼气样本采集与分析：采用标准化采样程序，参与者禁食、禁烟、禁酒至少1小时后，用力平稳地向与电喷雾萃取电离质谱（EESI-MS）装置耦合的线性离子阱质谱仪（LTQ-Velos，赛默飞世尔科技公司，美国）呼出气体20秒，在正离子模式下获取质谱图（质荷比m/z范围50.00–950.00）。原始质谱经过去背景、总离子流（TIC）归一化和对数加一（log1p）变换等预处理后，最终得到451个呼气分子特征。2）舌象特征获取与分析：采用标准化的智能手机舌象成像系统，在高清摄像头固定参数（光圈f/1.8，感光度ISO 100，快门速度1/100秒）及标准化光照条件（色温5000 K，照度4800 lx）下采集每位参与者的舌体和舌下视图图像。通过图像处理提取了28个舌象特征（包括RGB通道均值与标准差、颜色指数、色调饱和度明度HSV饱和度均值、感兴趣区域覆盖率及灰度纹理指标）。3）机器学习建模与验证：研究人员开发了逻辑回归、随机森林和极端随机树三种机器学习模型。所有模型均采用5折分层交叉验证进行性能评估，在每个训练折内独立进行特征选择以防止数据泄露。基于451个呼气分子特征构建了BreathGOUT模型；结合临床特征（年龄、身体质量指数BMI、吸烟史、饮酒史、家族史）构建了BreathRiskGOUT模型；整合呼气分子特征、临床特征和舌象特征构建了三模态BreathGOUT-Plus模型。此外，还单独基于临床特征和舌象特征构建了RiskGOUT和TongueGOUT模型作为对照。
研究结果
3.1 基线临床特征：研究队列包含99名痛风患者和102名健康对照者。两组间年龄相当，但痛风组的身体质量指数（BMI）显著高于健康对照组（P < 0.001）。痛风患者的血清尿酸水平显著高于健康对照组（P < 0.001）。痛风组的饮酒史比例更高（P < 0.001），吸烟史差异也具有统计学意义（P = 0.012）。痛风家族史的差异接近统计学显著性。
3.2 呼气分子特征差异及候选生物标志物筛选：通过对所有201名参与者的呼气样本进行EESI-MS分析，共量化了451个呼气分子特征。通过非参数检验结合错误发现率（FDR）校正和火山图分析，最终筛选出12个关键的质荷比（m/z）特征作为候选生物标志物。这些特征被暂定为烷烃衍生物（m/z 57.0）、芳香烃衍生物（m/z 79.0）、甲酚（m/z 107.0）、己酸（m/z 114.0）、乙酰丙酸（m/z 115.0）、环烷醇（m/z 128.0）、肌苷（m/z 145.0）、马尿酸（m/z 177.0）、槲皮素（m/z 287.0）、尿酸盐二聚体（m/z 318.0）、甘油三酯（m/z 390.0）和鹅去氧胆酸（m/z 392.0）。其中，m/z 318.0（假定尿酸盐二聚体）信号在痛风组中显著上调，其余11种离子均下调。这些单个特征的AUC大多超过0.90，显示出强鉴别信号。
3.3 舌象及舌下图像特征分析：研究人员从每位受试者提取了28个舌象特征。经过Mann-Whitney U检验和Benjamini-Hochberg FDR校正后，三个舌体特征在两组间显示出显著差异。痛风患者的舌体红度指数显著降低（FDR q < 0.001），这与痛风患者常见的暗红舌外观一致；舌体白度指数显著升高（FDR q < 0.001），提示白苔积累增加；舌体饱和度也显著降低（FDR q = 0.004），表明舌体色彩鲜明度下降。舌下视图的七个特征均未达到统计显著性。
3.4 模型构建与验证：研究人员基于五种特征配置开发了诊断模型。基于451个呼气分子特征的BreathGOUT模型（最佳算法为极端随机树）表现最优，通过5折分层交叉验证实现了0.999（95% CI 0.997–1.000）的AUC，准确度、敏感度和特异度均为0.990。BreathRiskGOUT和BreathGOUT-Plus模型同样达到了0.999的AUC，但并未进一步提升性能，表明本数据集中主要的诊断信息来源于呼气分子特征。相比之下，仅基于5个临床变量的RiskGOUT模型（最佳算法为逻辑回归）的AUC为0.890（95% CI 0.840–0.930），而仅基于28个舌象特征的TongueGOUT模型（最佳算法为极端随机树）的AUC仅为0.654（95% CI 0.578–0.728）。这形成了清晰的三个梯度区分能力：基于呼气的模型AUC约0.999，基于临床特征的模型平均AUC为0.871，基于舌象的模型平均AUC为0.628，突显了诊断信号主要来自呼气代谢物特征。
讨论与结论
讨论部分指出，基于呼气分子特征的诊断模型具有采样简便、实时快速检测、无创以及可重复用于动态监测等优势。本研究发现，通过机器学习分析的呼气分子特征在区分痛风患者与健康对照者方面展现出令人鼓舞的区分能力。与传统诊断方法在早期疾病中的敏感性受限相比，该模型提供了一种有前景的无创替代方案。研究人员强调，本研究的优势在于呼气分子特征信号的稳健性，所识别的特征很可能反映了真实的疾病相关代谢扰动，而非随机噪声。然而，作为一项初步的单中心研究，样本量有限，应谨慎解读这些发现。
关于BreathGOUT模型高达0.999的AUC，研究人员进行了深入讨论。虽然基线特征（如BMI、饮酒史、吸烟史）在两组间存在显著不平衡，但单模态分解分析显示了一个清晰的三级区分梯度：RiskGOUT的平均AUC为0.871，与BreathGOUT的0.999之间存在0.128的差距，这在诊断测试中被认为具有临床意义。这表明临床特征仅解释了组间分离的一部分，而呼气代谢物衍生信号贡献了剩余的特异性疾病信息，使区分能力提升至如此高的水平。换句话说，呼气分子特征可能捕获了传统表型风险评估无法触及的代谢维度。然而，研究人员也承认，当前数据尚未确立与临床混杂因素的独立性，未进行BMI分层或倾向评分匹配分析。
在12个差异呼气分子特征中，只有m/z 318.0（假定尿酸盐二聚体）上调，其余11个离子下调。m/z 318.0的增加可能与尿酸积累一致，但需要串联质谱确认。其余离子的协调下调模式虽引人关注，但这些鉴定仍是暂定的，其生物学解释未经确认的结构或功能数据支持，属于推测性质。
关于多模态融合模型，尽管BreathGOUT-Plus未能在AUC上超越单模态BreathGOUT模型，但研究人员认为其在临床和研究层面仍有独特价值。其主要优势不在于提升分类性能本身，而在于加强整合临床诊断的逻辑。多模态整合可能通过利用稳定的临床特征（如BMI、家族史）来校准受短期外部因素（如近期高嘌呤摄入、酒精摄入）扰动的呼气分子特征信号，从而提高临床稳健性。此外，当不同模态的预测风险不一致时，这种不一致本身可成为独立的临床线索，有助于区分短期扰动与稳定状态。舌象与呼气分子特征的协同作用还可能帮助建立中医证候模式与嘌呤代谢失调之间的联系，提高中西医结合诊断的可解释性。
研究人员客观陈述了本研究的若干局限性：单中心设计且样本量适中（n=201），限制了普适性；关键生物标志物m/z 318.0（尿酸盐二聚体）为暂定鉴定，未使用标准品或MS/MS碎裂确认；尽管采用了单模态分解分析，但未进行严格的亚组分层分析如BMI分层或倾向评分匹配；舌象采集中相机距离和伸舌持续时间未定量记录，可能引入残余变异；基线时未系统评估肾功能；观察到两组间总信号强度的显著全局差异，其生物学或技术来源尚不清楚。
结论：总之，在这项单中心概念验证研究中，对呼气分子特征的机器学习分析准确地区分了已确诊的痛风状态与健康状态，并鉴定了12个候选离子作为推定生物标志物，其区分性能在很大程度上与传统临床特征互补，尽管尚未证明独立于后者。然而，有限的单中心病例对照队列、分子注释的暂定性以及缺乏外部验证限制了这些发现的普适性。有必要开展纳入无症状高尿酸血症、首次发作关节炎及其他关节炎的多中心前瞻性研究，以确立呼气代谢组学在痛风早期检测和管理中的转化潜力。
