《Frontiers in Pharmacology》：Effects of St. John’s Wort extract on the release of paracrine markers and neurite outgrowth in mouse hippocampal HT-22 neuronal cells co-cultured with SIM-A9 microglia
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背景：贯叶连翘（Hypericum perforatum L.），通常称为圣约翰草（St. John’s wort, SJW），传统上用于治疗包括抑郁症在内的神经系统疾病。长期应激事件可影响神经元和小胶质细胞的功能并诱发抑郁症。然而，这些过
中文摘要翻译：
背景：贯叶连翘（Hypericum perforatum L.），通常称为圣约翰草（St. John’s wort, SJW），传统上用于治疗包括抑郁症在内的神经系统疾病。长期应激事件可影响神经元和小胶质细胞的功能并诱发抑郁症。然而，这些过程的分子机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨一种特殊的SJW提取物STW3-VI对体外小胶质细胞与神经元之间旁分泌信号的影响。方法：将小鼠SIM-A9小胶质细胞（SIM-A9）与小鼠海马HT-22神经元细胞（HT-22）共培养，分别以不同浓度的SJW、SJW的活性成分金丝桃苷、艾司西酞普兰或神经生长因子（nerve growth factor, NGF）处理，后者作为阳性对照。为进一步阐明旁分泌信号，采用细胞活力检测、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、神经突生长分析、迁移实验及ProteomeProfile?蛋白组学筛查方法。结果：HT-22细胞与SIM-A9共培养后，经SJW、艾司西酞普兰、金丝桃苷或NGF处理，与阴性对照组相比均刺激神经突形成。以ProteomeProfiler?进行筛查并以ELISA进行验证，结果表明：在小鼠SIM-A9存在的情况下，0.50 μg/mL SJW、0.019 μg/mL金丝桃苷或2.10 μg/mL艾司西酞普兰均可显著增加胆碱能分化因子（cholinergic differentiation factor, CDF/LIF）的释放。小鼠海马HT-22细胞经艾司西酞普兰、金丝桃苷或NGF处理后，抗炎细胞因子白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）的释放增加。值得注意的是，SJW和金丝桃苷在共培养体系中抑制了生长分化因子15（growth differentiation factor 15, GDF-15）的释放。所有实验均在未受刺激的共培养条件下进行。结论：研究数据显示，在无外部刺激的未刺激共培养条件下，HT-22细胞在SIM-A9细胞存在时CDF/LIF水平升高、SIM-A9小胶质细胞GDF-15释放减少以及神经突生长受刺激，这些变化可能提示SJW对旁分泌释放及神经突生长具有潜在作用。此外，结果还表明金丝桃苷、艾司西酞普兰和NGF可增强IL-10释放。由于研究结果源自体外实验，只能推测类似效应可能发生于抑郁症患者中。仍需进一步的体外、体内及临床研究以验证这一假说。
论文解读文章：
**研究背景与科学问题**
重度抑郁症（major depressive disorder, MDD）是一种同时影响精神与身体健康的疾病，构成重大的公共卫生负担。目前关于MDD的三大主流假说包括单胺类神经递质耗竭、神经可塑性下降以及下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴功能紊乱。然而，这些假说在解释具体病理机制方面仍存在不足，尤其是对中枢神经系统（central nervous system, CNS）中非神经元细胞的参与机制认识有限。慢性应激及其引发的神经损伤是抑郁症病理生理的关键因素。在此背景下，小胶质细胞作为CNS固有免疫系统的重要组成部分，通过调控突触微环境、突触形成与修剪影响神经元可塑性。小胶质细胞与神经元之间的通讯紊乱与多种脑部病理状态相关，包括抑郁症。旁分泌信号（paracrine signaling）——即通过分泌可溶性配体介导的细胞间通讯——是小胶质细胞与神经元相互作用的主要机制，具有双向性和交互性。然而，调控突触修剪与神经元可塑性所依赖的具体旁分泌信号分子仍不清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在探讨SJW提取物STW3-VI对 hippocampal HT-22神经元细胞与SIM-A9小胶质细胞在未刺激共培养条件下相互作用的影响。
**研究内容与结论**
本研究采用小鼠海马HT-22神经元细胞（HT-22）与小鼠SIM-A9小胶质细胞（SIM-A9）建立的体外共培养体系，以SJW提取物为核心受试物，以金丝桃苷（hyperoside, HS，SJW主要活性黄酮成分之一）、艾司西酞普兰（escitalopram, EC，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类抗抑郁药）为对照药物，并以神经生长因子（nerve growth factor, NGF）作为神经突生长的阳性对照。研究使用未受刺激的共培养条件，即不添加脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）等促炎刺激物，以观察基础状态下各药物对神经元-小胶质细胞旁分泌相互作用的调节效应。研究得出以下主要结论：在未刺激共培养条件下，与仅培养HT-22细胞相比，HT-22细胞与SIM-A9细胞共培养后经SJW处理，可显著促进神经突生长；共培养体系中SJW、金丝桃苷及艾司西酞普兰可显著增加胆碱能分化因子/白血病抑制因子（cholinergic differentiation factor/leukemia inhibitory factor, CDF/LIF）的释放；金丝桃苷、艾司西酞普兰和NGF处理可增强抗炎细胞因子白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）的释放；SJW和金丝桃苷可抑制生长分化因子15（growth differentiation factor 15, GDF-15）的释放。该研究首次报道了SJW及其活性成分对HT-22神经元细胞与SIM-A9小胶质细胞共培养体系中CDF/LIF、GDF-15和IL-10等旁分泌标志物的调节作用，提示SJW可能通过旁分泌途径发挥神经保护与抗炎效应，为理解SJW的抗抑郁作用机制提供了新的实验依据。
**主要关键技术与方法**
研究采用了以下主要技术方法：（1）细胞共培养模型：小鼠海马HT-22神经元细胞与小鼠SIM-A9小胶质细胞通过Transwell插入式培养系统进行非接触共培养，以避免细胞间直接接触，从而聚焦旁分泌信号研究；（2）细胞活力检测：采用PrestoBlue?细胞活力试剂评估药物细胞毒性，以确定非细胞毒性处理浓度；（3）神经突生长定量分析：使用神经突生长染色试剂盒结合荧光酶标仪进行相对荧光定量；（4）蛋白组学筛查与验证：采用ProteomeProfiler?小鼠XL细胞因子抗体芯片对111种细胞因子/趋化因子进行半定量筛查，筛选出差异表达候选标志物后，用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行定量验证；（5）迁移能力检测：采用划痕愈合实验评估HT-22细胞的迁移能力；（6）统计分析采用单因素方差分析及相应的事后检验。所有实验均在未受刺激的共培养条件下进行。
**研究结果**
**3.1 SJW、金丝桃苷和艾司西酞普兰对细胞活力的影响**
研究人员首先评估了不同浓度受试物对HT-22细胞和SIM-A9细胞的细胞毒性。结果显示，SJW在较高浓度（2.0、5.0和10.0 μg/mL）下可使HT-22细胞活力显著降低约10%–13%；金丝桃苷在0.094、0.19和0.38 μg/mL浓度下使HT-22细胞活力降低约10%–13%；而艾司西酞普兰在所测浓度范围内对HT-22细胞无细胞毒性。对于SIM-A9小胶质细胞，仅艾司西酞普兰在40、80和100 μM浓度下显著抑制细胞活力（降幅10.8%–21.0%），SJW和金丝桃苷对其活力无明显影响。后续共培养实验选用非细胞毒性浓度。
**3.2 SJW、金丝桃苷和艾司西酞普兰对神经元神经突生长的影响**
研究发现，单独培养的HT-22细胞经各受试物处理后，神经突生长与对照组相比无显著差异。然而，当HT-22细胞与SIM-A9小胶质细胞共培养时，各受试物显著促进神经突形成。具体而言，0.25和0.50 μg/mL SJW使神经突生长分别增加1.75倍和2.10倍；0.0094和0.019 μg/mL金丝桃苷分别增加2.1倍和1.8倍；2.10和4.2 μg/mL艾司西酞普兰分别增加3.53倍和5.9倍；NGF（阳性对照）增加3.22倍和5.14倍。值得注意的是，未处理共培养对照组（control 2）的神经突生长较单独培养对照组降低2.3倍，提示小胶质细胞存在对基础神经突生长有一定抑制作用。
**3.3 SJW、金丝桃苷和艾司西酞普兰对TNF-α和IL-6释放的影响**
ProteomeProfiler?筛查显示，无论有无SIM-A9共培养，各受试物处理均未改变肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的释放水平。ELISA验证结果与筛查一致。共培养对照组中TNF-α基线水平为25 pg/mL，IL-6基线水平为92.6 pg/mL，均低于文献报道的促炎刺激水平。这表明实验确实处于未受刺激条件，排除了促炎状态对观察结果的干扰。
**3.4 SJW、金丝桃苷和艾司西酞普兰对BDNF释放的影响**
脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）是突触可塑性的关键调节因子。研究发现，共培养本身使BDNF释放降低3.5倍。在共培养条件下，0.25和0.50 μg/mL SJW使BDNF释放较HT-22单独培养相应处理组显著降低2.6倍和2.5倍；艾司西酞普兰和NGF也抑制BDNF释放。与文献中"高BDNF促进神经突生长"的预期不同，本研究中BDNF释放下降伴随神经突生长增加，提示可能有其他旁分泌因子介导了SJW的促神经突生长效应。
**3.5 SJW、金丝桃苷和艾司西酞普兰对HT-22细胞迁移能力的影响**
划痕愈合实验显示，无论有无SIM-A9共培养，各受试物处理对HT-22细胞的迁移能力均无显著影响。研究人员推测这可能与HT-22细胞倍增时间较短（约15小时），增殖过程掩盖了迁移效应有关。
**3.6 ProteomeProfiler?和ELISA检测的旁分泌蛋白标志物**
**3.6.1 胆碱能分化因子/白血病抑制因子（CDF/LIF）**
ProteomeProfiler?筛查发现，HT-22与SIM-A9共培养后，0.25和0.50 μg/mL SJW使CDF/LIF释放较HT-22单独培养相应处理组增加38.1%和15.0%；0.019 μg/mL金丝桃苷和2.10 μg/mL艾司西酞普兰分别增加46.6%和33.9%。ELISA验证结果进一步确认了上述趋势：0.25和0.50 μg/mL SJW使共培养组CDF/LIF释放较单独培养组显著增加19.6%和34.7%；金丝桃苷、艾司西酞普兰和NGF分别显著增加26.1%、45.5%和52.5%。与共培养对照组相比，0.50 μg/mL SJW使CDF/LIF释放显著增加35.2%。细胞裂解物ELISA分析未发现显著差异。
**3.6.2 白细胞介素-10（IL-10）**
ProteomeProfiler?筛查显示，SJW（0.25和0.50 μg/mL）使共培养组IL-10释放较HT-22单独培养组分别增加66.4%和37.6%；金丝桃苷、艾司西酞普兰和NGF分别增加44.7%、29.3%和15.8%。ELISA验证显示，金丝桃苷（0.019 μg/mL）、艾司西酞普兰（2.10 μg/mL）和NGF（0.10 μg/mL）在共培养条件下分别使IL-10释放较HT-22单独培养组显著增加52.7%、35.8%和54.4%；与共培养对照组相比，金丝桃苷、艾司西酞普兰和NGF分别显著增加15.6%、24.2%和35.7%。SJW对IL-10释放的促进作用在ELISA验证中未达到统计学显著性。
**3.6.3 生长分化因子15（GDF-15）**
ProteomeProfiler?筛查显示，共培养组中0.25 μg/mL SJW使GDF-15释放较HT-22单独培养组减少29.3%；0.019 μg/mL金丝桃苷减少29.0%。ELISA验证结果显示，0.50 μg/mL SJW使共培养组GDF-15释放较共培养对照组显著降低16.0%，0.019 μg/mL金丝桃苷显著降低17.5%。细胞裂解物分析显示，GDF-15仅在SIM-A9小胶质细胞裂解物中可检测到，在HT-22细胞裂解物中未检测到，表明GDF-15主要来源于小胶质细胞。
**讨论与结论**
在讨论部分，研究人员指出，本研究的核心发现——SJW和金丝桃苷在未刺激共培养条件下促进HT-22神经突生长、增加CDF/LIF释放、抑制GDF-15释放——提示SJW可能通过旁分泌途径调节神经元-小胶质细胞相互作用。CDF/LIF是CNS中关键的旁分泌信号分子，具有神经保护和抗炎作用，并可通过血脑屏障。研究首次报道SJW和金丝桃苷在共培养条件下上调HT-22细胞释放CDF/LIF，可能解释此前观察到的SJW抗炎和神经保护效应。GDF-15在应激和抑郁状态下常升高，而其水平降低可能具有治疗潜力，本研究首次报道SJW和金丝桃苷可抑制小胶质细胞释放GDF-15。研究还指出，虽然文献通常认为BDNF水平升高与神经突生长正相关，但本研究中BDNF下降伴随神经突生长增加，提示CDF/LIF可能是更关键的介导因子。研究局限性包括使用细胞系而非原代细胞、可溶性因子在培养体系中稀释无法准确定量各细胞类型的贡献、缺乏促炎刺激条件下的验证等。研究结论认为，在未刺激共培养条件下，SJW可通过增加HT-22细胞CDF/LIF释放、减少SIM-A9小胶质细胞GDF-15释放并刺激神经突生长发挥作用；金丝桃苷、艾司西酞普兰和NGF可增强IL-10释放。这些相互作用可能属于旁分泌机制，但需进一步的功能验证实验（如中和、基因沉默、受体抑制和条件培养基转移）以及体内和临床研究加以确证。该研究为SJW抗抑郁作用的细胞间通讯机制提供了新的实验证据，为抑郁症治疗靶点的探索提供了新思路。
