臭椿苦酮（ailanthone）靶向整合素β2（ITGB2）抑制HSV-1复制并缓解小鼠单纯疱疹性角膜炎

《Frontiers in Pharmacology》：Natural compound ailanthone alleviates herpes simplex keratitis in mice by inhibiting HSV-1 replication

　　

背景：由1型单纯疱疹病毒（HSV-1）感染引起的单纯疱疹性角膜炎（HSK）是一种常见眼部疾病，可导致角膜瘢痕和视力损害。由于当前抗病毒药物对HSK疗效有限，有必要探索治疗HSV-1感染相关疾病的新策略。目的：本研究旨在探讨植物来源天然化合物臭椿苦酮（ailanthone）作为治疗药物，减少HSV-1复制并缓解HSK进展的潜在作用。方法：研究人员筛选天然化合物库并进行体外实验，检测臭椿苦酮对HSV-1复制的抑制作用；网络药理学分析和分子对接将整合素β₂（ITGB2）优先确定为臭椿苦酮的潜在功能靶点。研究人员采用HSK小鼠模型进行体内实验，评价臭椿苦酮的抗病毒活性。结果：研究发现，臭椿苦酮是通过筛选鉴定出的强效HSV-1抑制剂。其通过下调支持病毒复制的宿主因子ITGB2，抑制体外病毒基因表达和病毒滴度。此外，在HSK小鼠模型中，低剂量（1 mg/kg）和高剂量（5 mg/kg）臭椿苦酮治疗显著减轻角膜病变并降低角膜病毒载量。结论：综上，本研究提供证据表明ITGB2支持HSV-1复制，并鉴定出一种植物来源天然化合物臭椿苦酮，其通过调节ITGB2表达抑制HSV-1复制，为HSK治疗提供了潜在药物候选物和治疗靶点。

单纯疱疹性角膜炎（HSK，由HSV-1感染引起的角膜疾病）是感染相关角膜视力损害的重要原因。HSV-1可在感觉神经节建立终身潜伏并再激活；HSK进展不仅由病毒复制和复发驱动，还涉及局部免疫炎症反应放大和组织损伤，最终导致角膜混浊、基质瘢痕和潜在不可逆视力障碍。当前临床治疗主要依赖核苷类似物，尤其是阿昔洛韦（ACV）及其衍生物，通过抑制病毒DNA复制控制急性感染；但其疗效依赖病毒编码酶，对耐药株、复发性角膜炎和持续炎症驱动组织损伤效果有限，且传统策略以病毒为中心，对促进病毒复制的宿主分子网络和炎症微环境干预有限。宿主导向抗病毒策略（HDTs）靶向病毒劫持的宿主机制，因宿主基因突变率低于病毒基因组，理论上具有更高耐药屏障。HSV-1进入、扩散和致病依赖宿主因子，整合素家族作为黏附分子和信号转导枢纽受到关注，但HSK中关键整合素亚型尚待明确。臭椿苦酮（ailanthone）是来源于臭椿（Ailanthus altissima）的苦木素类天然化合物，既往多关注抗肿瘤等活性，抗HSV-1作用未明；初步证据提示其具有抗HSV-1活性并可能调控整合素β₂（ITGB2，一种宿主细胞黏附分子），因此研究人员开展系统评价。

主要关键技术方法：研究人员先进行天然化合物库筛选，并以Vero、HCEC、ARPE-19及THP-1等细胞进行体外抗病毒评价；采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测病毒基因ICP0、ICP4、gD及炎症因子，Western blot检测蛋白，CCK-8测定细胞活力并计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）、半数有效浓度（EC₅₀）和选择指数（SI），空斑实验/50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定病毒滴度；通过时间添加和阶段特异实验定位病毒生命周期阶段。机制上采用网络药理学、分子对接、蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络和药物亲和反应靶点稳定性实验（DARTS），并用siRNA和过表达进行功能验证。体内采用6周龄雄性BALB/c小鼠（购自Qinglongshan，江苏，中国）建立HSK模型，角膜划痕后接种HSV-1F 1.2×10⁶ PFU，腹腔注射臭椿苦酮1或5 mg/kg或ACV 5 mg/kg；动物实验经Bengbu Medical University动物伦理批准（2025845）。

研究结果：
3.1 臭椿苦酮抑制Vero细胞中的HSV-1复制：研究人员用HSV-1F（感染复数MOI=1）感染Vero细胞并以100–3000 nM臭椿苦酮处理24 h，RT-qPCR显示ICP0、ICP4和gD转录呈剂量依赖性降低；CCK-8显示CC₅₀>10000 nM，EC₅₀=197.4 nM，SI>50；空斑形成和子代病毒滴度降低，IL-1B和TNF-α上调受抑制，结论为体外强效抑制HSV-1且安全窗较好。
3.2 臭椿苦酮抑制人角膜上皮细胞中的HSV-1复制：在人角膜上皮细胞（HCEC）中，臭椿苦酮（100–500 nM）减轻HSV-1F诱导的细胞病变效应（CPE）；RT-qPCR显示ICP0、ICP4和gD mRNA剂量依赖性降低；CC₅₀>10000 nM，EC₅₀=50.16 nM，SI>100；IL-1B和TNF-α表达受抑制，结论为在HSK主要靶组织角膜上皮细胞中保留强效抗病毒活性。
3.3 臭椿苦酮在ARPE-19细胞中抑制HSV-1包括ACV耐药株HSV-1/153，并作用于进入后复制阶段：在ARPE-19细胞中，臭椿苦酮CC₅₀=44354 nM，降低ICP0、ICP4、gD mRNA，减轻CPE，减少空斑和子代病毒滴度，并抑制IL-1B、TNF-α；对临床ACV耐药株HSV-1/153，臭椿苦酮浓度依赖性抑制gD mRNA，而ACV（1000 nM）作用很小；对HSV-1F和HSV-1/153的EC₅₀分别为35.05 nM和227.4 nM，SI均>100。时间添加实验显示从感染前2 h至感染后约12 h加药抑制近完全、之后迅速下降；阶段特异实验显示其不影响病毒吸附，但显著损害病毒进入，最明显抑制复制，结论为主要作用于进入后复制阶段，符合宿主导向机制而非直接中和病毒颗粒。
3.4 网络药理学和DARTS确定ITGB2为臭椿苦酮直接靶点：臭椿苦酮预测靶点与HSK相关靶点交集得到36个重叠靶点；PPI网络显示ITGB2为枢纽节点，KEGG富集显示重叠靶点显著富集于单纯疱疹感染通路；分子对接预测臭椿苦酮与ITGB2结合得分最高（?8.6 kcal/mol）。DARTS实验中，臭椿苦酮（2.5、5、7.5 μM）剂量依赖性保护THP-1细胞裂解物中的ITGB2免受Pronase E消化，ACV无保护作用；臭椿苦酮降低THP-1细胞ITGB2蛋白水平，并在HSV-1感染THP-1细胞中降低gD mRNA及ITGB2、gD蛋白水平，结论为ITGB2是臭椿苦酮的直接分子靶点。
3.5 ITGB2敲低模拟而ITGB2过表达抵消臭椿苦酮的抗病毒作用：三条独立siRNA敲低THP-1细胞ITGB2后，HSV-1感染细胞中gD mRNA和gD蛋白降低，子代病毒在Vero单层形成的空斑减少；ITGB2过表达增加THP-1细胞gD mRNA，并增加HSV-1感染细胞gD蛋白，部分抵消臭椿苦酮对gD蛋白的降低作用（在293T和ARPE-19细胞中亦如此），结论为臭椿苦酮抗病毒活性至少部分由下调ITGB2介导。
3.6 臭椿苦酮缓解HSV-1诱导的角膜炎并降低小鼠HSK模型角膜ITGB2表达：在BALB/c小鼠HSK模型中，腹腔注射臭椿苦酮（1或5 mg/kg）或ACV（5 mg/kg）；各组体重变化相当；臭椿苦酮（5 mg/kg）降低疾病评分，改善自然光和钴蓝光下角膜外观，降低3 dpi和5 dpi荧光素钠染色评分，减轻6 dpi苏木精-伊红（H&E）染色所示角膜炎症，并降低6 dpi眼拭子病毒滴度；免疫荧光（IF）显示HSK小鼠角膜ITGB2上调，臭椿苦酮剂量依赖性降低角膜ITGB2荧光强度，而ACV对 corneal ITGB2水平无显著影响，结论为体内减轻HSK进展并确认ITGB2下调是其宿主导向抗病毒作用的关键事件。

讨论与结论：研究人员基于HDTs概念系统评价臭椿苦酮，认为其可能通过调控宿主依赖因子ITGB2影响病毒复制和疾病进展。原文指出，宿主导向策略靶向较保守的宿主信号网络，可能降低病毒突变所致耐药风险；臭椿苦酮对ACV耐药株HSV-1/153在ARPE-19细胞中EC₅₀=227.4 nM、SI>100，并在HCEC中EC₅₀=50.16 nM、SI>100，支持其抗病毒作用不依赖病毒编码酶，并具有角膜上皮细胞转化相关性。ARPE-19作为眼上皮模型不能完全代表角膜上皮，HCEC验证弥补了该局限。ITGB2因在PPI网络中高度连接、分子对接排名最高、富集于单纯疱疹感染通路且作为整合素亚基参与白细胞黏附和炎症信号而被优先验证；DARTS提供臭椿苦酮与ITGB2特异性相互作用的生化证据。原文指出，臭椿苦酮降低ITGB2丰度的确切机制尚未完全解析，涉及转录或mRNA稳定性以及蛋白降解等可能，需专门实验验证；时间添加和阶段实验显示其不影响吸附而主要抑制进入后复制，与ITGB2作为信号平台而非经典HSV-1进入受体的作用方式相符。ITGB2可能同时参与细胞骨架重塑、信号转导、白细胞迁移和炎症放大，臭椿苦酮下调ITGB2可能同时影响病毒复制和炎症。体内实验中，臭椿苦酮减轻疾病评分、角膜混浊、荧光素染色和眼拭子病毒载量，并通过盲法炎症评分提供角膜保护证据；免疫荧光显示HSK角膜ITGB2上调且臭椿苦酮剂量依赖性降低，而ACV无显著影响，体现二者机制差异。原文还指出局限：ITGB2下调机制、整合素网络冗余、多靶点作用、局部给药眼内药代动力学、长期角膜毒性和重复给药安全性、急性原发感染模型与临床复发负担差异、下游信号因果贡献等尚待研究。研究结论（译）：综上，本研究从宿主依赖网络角度提供证据，臭椿苦酮直接靶向ITGB2，在进入后阶段抑制HSV-1复制，并在体内改善HSK进展。这些发现表明臭椿苦酮可能通过调节宿主依赖过程发挥抗HSV-1作用，并为宿主导向治疗策略提供新见解。在宿主与病毒复杂相互作用背景下，靶向ITGB2等关键调控节点可能代表未来抗病毒治疗的有希望方向。