磁富集联合流式细胞术实现加标及临床外周血样本中持久性CAR-T细胞的高灵敏检测

《Frontiers in Immunology》：Magnetic enrichment–coupled flow cytometry for highly sensitive detection of persistent CAR-T cells in spiked and clinical peripheral blood samples

背景： 嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的长期监测对于评估治疗效果至关重要，尤其是在输注后循环CAR-T细胞水平下降的情况下。尽管定量实时PCR（qPCR）能够高灵敏地检测CAR转基因，但其缺乏单细胞分辨率、表型表征以及评估细胞活力的能力。 方法： 在本研究中，研究人员在MACSQuant流式细胞仪上适配并验证了一种自动化富集模式，该模式将自动化免疫磁富集与多参数流式细胞术分析相结合，以提高检测和定量稀有CAR-T细胞群体的灵敏度。该检测方法的检测限及潜在临床实用性通过在外周血单个核细胞（PBMC）背景中的CAR-T细胞加标实验以及接受CD19靶向CAR-T细胞治疗的患者临床血样进行了评估。结果与用于载体拷贝数（VCN）检测的互补性qPCR检测方法进行了比较。 结果： 基于富集的工作流程通过选择性富集CAR-T细胞同时排除非靶向外周血白细胞，实现了当天检测存活CAR-T细胞，从而在输注后患者样本中极低细胞频率下显著提高了检测灵敏度。富集偶联流式细胞术工作流程与qPCR之间观察到一致的CAR-T细胞检测结果。虽然qPCR作为高灵敏转基因检测的正交方法，但基于富集的流式细胞术工作流程提供了额外的单细胞信息，包括存活CAR-T细胞频率和表型表征。 结论： 通过将增强的灵敏度与单细胞及功能性分辨率相结合，这种富集偶联流式细胞术工作流程补充了基于qPCR的基因组检测，并可作为接受CAR-T细胞治疗患者中CAR-T细胞持久性纵向监测的快速、准确且具有临床价值的工具。

论文解读：CAR-T细胞持久性监测的新策略——磁富集偶联流式细胞术

一、研究背景与意义

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已彻底改变了复发或难治性B细胞恶性肿瘤的治疗格局，为既往治疗选择有限的患者带来了持久缓解。长期疾病控制密切依赖于输注后CAR-T细胞的体内持久性与功能活性。因此，多项研究及近期共识指南强调，应持续监测CAR-T细胞的体内持久性，因为可检测时间的延长与患者无事件生存期和总生存期的改善相关。尽管B细胞再生障碍（BCA）仍是抗CD19 CAR-T活性的临床替代指标，但直接定量循环CAR-T细胞能提供更精细的细胞水平视角，有助于临床决策。

输注后CAR-T细胞的外周血动力学通常呈双相模式：早期抗原驱动的扩增在输注后1至2周达峰，随后收缩，最终进入由记忆样T细胞表型分化驱动的长期低水平持久阶段。早期扩增与初始细胞因子释放综合征及肿瘤控制相关，而长期低水平持久则与持续肿瘤监视和长期缓解相关。然而，尽管持久性具有重要临床意义，输注后CAR-T监测的标准化诊断工具和共识指南仍然有限。

分子方法如定量PCR（qPCR）和下一代测序（NGS）对CAR转基因序列和微小残留病具有较高的分析灵敏度，但它们评估的是批量核酸，无法直接报告输注后循环CAR-T细胞的单细胞活力和免疫表型。多参数流式细胞术提供单细胞分辨率数据，允许同时进行存活CAR-T细胞的表型表征，实现快速当天评估。然而，常规流式细胞术因背景噪声和事件区分挑战，在复杂临床样本中检测超稀有CAR-T群体时可能缺乏所需灵敏度。

免疫磁预富集可选择性浓缩靶细胞，克服上述局限，提高检测灵敏度同时保留富集CAR-T群体的表型表征。将自动化磁富集与高参数流式细胞术整合于全集成平台，可提供可扩展、标准化的CAR-T监测方案，减少操作者依赖性变异，提高工作流程可重复性。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员利用MACSQuant自动化磁富集平台开发了一套简化检测流程，旨在检测外周血单个核细胞（PBMC）样本中的稀有CAR-T细胞。主要技术方法包括：

1. 1.
   自动化免疫磁富集偶联流式细胞术：采用MACSQuant Analyzer 10的EnrichS自动化富集模式，将免疫磁分离直接整合至仪器工作流程中，在流式获取前对低频靶细胞进行自动化预富集。磁标记的CAR-T细胞被保留于分离柱内，大部分未标记单个核细胞被去除，显著提高靶细胞频率。
2. 2.
   多参数流式细胞术分析：使用CAR-T Cell Express Mode的CAR-T细胞转导h-02软件，应用预定义门控策略和标准化分析模板，对CAR-T群体进行可重复的鉴定和表征。CAR-T细胞频率计算为存活CD45⁺CD3⁺亲本细胞的百分比。
3. 3.
   体积计数定量：MACSQuant Analyzer 10采用体积计数技术，无需计数微球或外部参考标准即可直接测量绝对细胞计数。绝对CAR-T细胞计数通过将存活CAR-T细胞在存活CD3⁺T细胞群体中的频率乘以绝对CD3⁺T细胞计数获得。
4. 4.
   qPCR载体拷贝数（VCN）检测：使用MACS^?COPYcheck Kit和TaqMan Fast Advanced Master Mix进行VCN测定，作为CAR转基因检测的正交确认方法。
5. 5.
   样本队列：加标实验使用健康供者PBMCs，按10⁷:10⁶至10⁷:10²比例（对应10%至0.001%频率）加标CD19-或BCMA-CAR-T细胞；临床样本来自10例既往接受CD19靶向CAR-T细胞治疗的患者，按CAR-T频率分为≥10%、1-10%、0.1-1%和0.01-0.1%四组。

三、研究结果

3.1 自动化免疫磁富集显著提高MACSQuant Analyzer对低频CAR-T细胞的高分辨检测灵敏度

通过使用健康供者PBMCs的加标实验验证平台灵敏度和可重复性。在未富集（UnEnr）样本中，基线频率与理论输入比紧密匹配，跨越从10%到0.001%的四log范围。经自动化富集（AutoEnr）后，CD19-和BCMA-CAR-T群体在所有稀释度下均表现出显著的可检测频率增加。最高输入比（10%和1%）富集后纯度接近90%；基线频率低至0.1-0.01%的样本富集后CAR-T信号增至约20%和7-9%；即使在最低0.001%输入条件下，靶细胞也被浓缩至约1.4-1.7%的可定量信号。整个富集过程中细胞活力保持在95.34%至98.76%之间。CAR阴性PBMC空白对照仅观察到可忽略的CAR阳性背景事件，CD19和BCMA-CAR的平均背景信号分别为0.000075%和0.000069%。同型对照染色产生的背景信号约0.0001%，低于检测阈值。统计分析确认自动化工作流程在所有实验条件下均显著增加CAR-T细胞频率（P<0.0001）。

3.2 qPCR检测加标PBMCs中CAR-T细胞载体拷贝数可在低频率下检测CAR-T细胞

qPCR VCN检测在三次加标实验中的两次中，在CAR-T与PBMC比例为1:100000时检测到载体Gag DNA序列，支持CAR-T细胞检测的灵敏度。该qPCR检测下限与未富集PBMCs的流式细胞术数据相匹配，CD19-CAR-T细胞的VCN检测下限为0.0098，BCMA-CAR-T细胞为0.016。三次qPCR实验中一次在0.001%水平出现未检出结果，可能反映了接近检测限的超低靶频率下的随机采样效应。

3.3 自动化免疫磁富集实现输注后患者样本中稀有CAR-T细胞的高灵敏检测

对10例CD19-CAR-T细胞输注后患者的PBMC样本进行分析。自动化富集在所有基线丰度范围内均产生显著且可重复的CAR-T细胞可检测频率增加。基线频率≥10%的样本，富集后平均CAR-T群体从12.9%±2.1%增至88.9%±5.7%；1-10%组从2.0%±0.8%增至53.9%±4.9%；0.1-1%组从0.44%±0.20%增至23.0%±1.8%；极低基线频率组（0.01-0.1%）从0.034%±0.013%富集至5.82%±1.16%。此外，基于未处理全血样本的绝对CAR-T细胞计数也已计算，反映了未经富集或样本操作的天然CD3⁺区室中CAR-T细胞的真实体内频率。

四、讨论与结论

本研究证明，将自动化免疫磁富集与多参数流式细胞术整合于MACSQuant平台，为稀有CAR-T群体的灵敏检测提供了优越解决方案，弥合了qPCR或ddPCR分子检测灵敏度与细胞活力及亚群鉴定分辨率之间的差距。主要发现是富集工作流程显著提高了CAR-T细胞检测灵敏度：在0.001%最低稀释度下，靶细胞被浓缩至CD19-CAR的1.66%和BCMA-CAR的1.38%，相当于信号噪声比近800倍提升，物理去除超过99.9%的非靶PBMCs。CD19-和BCMA-CAR构建体之间的一致性表明该平台高度通用，不依赖于特定CAR抗原亲和力。与qPCR相比，流式细胞术可检测存活细胞表面的CAR表达，直接评估治疗活性细胞群体，且可实现当天分析。临床样本验证支持该方法在临床环境中检测和监测稀有CAR-T群体的可行性。

研究局限性包括：患者队列相对较小，主要作为技术概念验证；未来需要更大规模、更多样化的纵向患者队列来建立CAR-T持久性、表型谱与临床结局之间的关联。结论是，该研究描述了一种新型的过继细胞免疫治疗后稀有CAR-T细胞检测方法。自动化免疫磁富集选择性浓缩CAR-T细胞，显著增强稀有群体的可检测信号而不增加非特异性背景事件，保留了单细胞分辨率和表型表征，同时需要最少的实际操作并提供快速周转时间。该方法可进一步优化和扩展，以支持接受CAR-T细胞治疗患者的CAR-T持久性、免疫重建和治疗反应的常规临床监测。