阿尔茨海默病相关四倍体神经元中选择性富集的体细胞单核苷酸变异及其氧化应激与DNA修复通路特征

《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Specific enrichment of somatic single nucleotide variants in Alzheimer-associated tetraploid neurons

　　

在阿尔茨海默病（AD）患者脑中观察到的一种早期病理过程是神经元细胞周期重新激活，随后发生体细胞性神经元四倍体化（NT）。NT随年龄增长而增加，并且衰老已被证明与神经元DNA体细胞突变的积累相关。本研究评估了AD患者顶叶皮质四倍体神经元基因组DNA中的体细胞突变，包括单核苷酸变异（SNVs）和短插入或缺失（INDELs），并与对照个体及AD患者的二倍体神经元进行比较。研究人员发现，与体细胞INDELs相比，四倍体神经元外显子组中的体细胞SNVs（sSNVs）显著增加，并伴有T到C（互补链A到G）转换水平升高，这是一种与氧化应激相关的突变类型。该发现与sSNVs在参与氧化应激反应和DNA修复的基因中过度富集相关，其中DNA修复基因显示出显著升高的分子致病性评分（MPS）。此外，影响癌症和衰老相关基因的sSNVs比随机基因样本中的sSNVs具有更高的MPS。研究人员提出一个模型：在氧化应激下，携带DNA修复基因突变的神经元中可能随机触发神经元四倍体化，并可能加剧氧化性DNA损伤。这可能促进细胞周期进展，随后在受累神经元中发生四倍体化和衰老，该过程可能参与AD的发病机制。

本研究围绕AD相关神经元四倍体化（NT，指神经元获得四倍单倍体DNA含量即4C状态）与体细胞突变积累之间的关系展开。AD是最主要的痴呆原因，其早期病理事件之一是神经元重新进入细胞周期，随后发生DNA合成和神经元超二倍体化，部分神经元形成四倍体状态；既往证据显示NT先于并再现AD病理，NT比例在Braak V/VI患者顶叶和前额叶皮质中升高，且阻止NT可改善5xFAD小鼠认知。然而，导致AD神经元细胞周期再进入和体细胞性神经元四倍体化（SNT）的机制尚不清楚。衰老是散发性AD的主要危险因素，并与神经元体细胞突变积累相关，因此研究人员假设AD相关四倍体神经元可能富集年龄相关体细胞突变，尤其是SNVs和INDELs，并对此进行全外显子组水平分析。

方法上，研究人员使用Banco de Tejidos Fundación CIEN（西班牙马德里）和Banco de Cerebros de la Región de Murcia（西班牙穆尔西亚，Hospital Virgen de la Arrixaca）提供的顶叶皮质样本，纳入AD患者（n=3，Braak V/VI）和对照（n=3，Braak 0）。分离NeuN+神经元核，流式分选二倍体（2C）和四倍体（4C）核，全基因组扩增后进行全外显子测序；用VarScan 2和LoFreq识别SNVs与INDELs，结合群体、功能、癌症和临床数据库注释，并以Signal进行单碱基替换（SBS）突变签名拟合，以Dreamgenics DG评分计算MPS；采用bootstrap评估小样本结果的稳定性。

结果部分：3.1 AD患者四倍体神经元中SNVs增加而INDELs不增加：通过比较AD 4C、AD 2C和对照2C神经元，发现AD来源四倍体神经元总突变较AD二倍体神经元增加16%，其中SNVs增加17%，INDELs无显著差异；AD二倍体与对照二倍体间无显著差异。3.2 AD患者四倍体神经元中新发SNVs特异性增加：通过等位基因频率（AF）分布分析，以AF<0.25界定sSNVs，发现AD 4C中sSNVs较对照2C增加45%，而gSNVs在AD 2C与4C间相似且低于对照；sSNVs在19号染色体富集。3.3 AD患者四倍体神经元sSNVs的选择性基因组定位和特定功能：通过基因组区域和功能注释，发现sSNVs较gSNVs富集于编码区，四倍体神经元内含子sSNVs减少、5′-UTR sSNVs增加、启动子sSNVs增加；内含子受体序列sSNVs减少，剪接和停获突变减少，错义sSNVs富集且在四倍体神经元中增强，提示蛋白功能异常而功能结构域相对保留。3.4 四倍体神经元sSNVs富集T到C（T>C）转换：通过突变类型分析，发现T>C转换在四倍体神经元sSNVs池中显著富集，且4C特异性SNVs中T>C显著增加。3.5 AD相关四倍体神经元中超低频sSNVs积累及T>C富集：用LoFreq复核AF<0.05的sSNVs，确认其在4C神经元中显著富集，频率峰约0.01，并确认T>C转换显著富集；突变签名以SBS123为主，AD 4C中SBS123贡献更高，次级签名呈SBS116/SBS5组合，而AD 2C以SBS123联合SBS102为主。3.6 sSNVs在神经退行性疾病相关基因中富集：通过AD风险基因和PD风险基因集分析，AD 4C中AD风险基因sSNVs增加59%（全基因组为45%），PD风险基因sSNVs也增加64%，gSNVs降低；个别AD风险基因中sSNVs增加或减少。3.7 sSNVs在氧化应激相关基因中富集：通过氧化应激相关基因集分析，四倍体神经元中抗氧化活性、活性氧反应、过氧化氢和氧化应激相关基因的sSNVs分别增加64%、61%、36%和33%，而氧化应激性细胞死亡和超氧化物歧化酶（SOD）活性相关基因无显著增加；gSNVs多降低。3.8 sSNVs在DNA修复相关基因中富集：通过DNA修复基因集分析，四倍体神经元总体DNA修复基因sSNVs增加64%，碱基切除修复（BER）、错配修复（MMR）和核苷酸切除修复（NER）相关sSNVs分别增加61%、52%和28%，双链断裂修复（DSBR）无显著增加；gSNVs降低。3.9 癌症相关和衰老相关基因sSNVs未见富集：通过癌症相关（CR）和衰老相关（SR）基因集分析，4C中CR基因sSNVs增加23%，SR基因增加21%，低于全基因组45%，与对照基因集相近，故未显示富集。3.10 癌症相关和衰老相关基因相关sSNVs显示高MPS：通过DG预测评分及频率分布回归斜率评估MPS，CR和SR基因中的sSNVs较全部sSNVs显示高致病性变异显著富集。3.11 其他sSNVs的MPS可变：通过同样评分分析，氧化应激相关基因MPS可变，SOD活性、氧化应激和过氧化氢相关基因显著；DNA修复中BER、MMR、NER显著而DSBR不显著；衰老相关基因MPS显著高于对照；AD和PD风险基因未显示高于对照基因的致病能力。

讨论部分总结：本研究首次对AD患者顶叶皮质四倍体神经元体细胞突变进行分子特征描述，并与对照及AD二倍体神经元比较。低频率突变主要见于二倍体或四倍体神经元而非两者共有，且多不在现有多态性数据库中，支持其体细胞来源；但全基因组扩增可引入等位基因失衡、丢失和聚合酶错误，4C特异性T>C谱及独立参考签名相似性不支持单一WGA偏倚解释，但不能完全排除技术伪差。sSNVs富集于编码外显子和启动子，错义突变为主而停获和剪接影响较低，提示蛋白功能异常而结构域相对完整。突变签名分析显示四倍体状态并非出现独有签名，而是AD 4C中SBS123贡献增加及次级签名组合改变。研究未在AD二倍体神经元中检测到sSNVs显著增加，提示sSNV增加似乎特异于SNT。T>C转换可能与脂质过氧化和氧化性DNA损伤有关，DNA修复基因sSNVs富集提示修复能力下降可能促进其他突变积累，包括癌症和衰老相关基因；但预测致病性不等于功能受损，且不能证明因果关系。研究支持Zhu等提出的二次打击致癌样假说：氧化应激和DNA修复基因随机突变使神经元更易积累sSNVs，促进细胞周期再进入、四倍体化和衰老，参与AD发病。局限包括样本量小（每组n=3）、仅晚期AD（Braak V/VI）、无早期样本、未用正交测序或功能实验验证、不能确定sSNVs与四倍体化的时序和因果，WGA伪差不能完全排除。研究结论部分翻译：研究人员提出一个模型，即神经元四倍体化可能在氧化应激下于携带DNA修复基因突变的神经元中被随机触发，并可能加剧氧化性DNA损伤；这可能促进细胞周期进展，随后在受累神经元中发生四倍体化和衰老，该过程可能参与AD的发病机制。理解AD中神经元细胞周期再进入和SNT的机制将有助于设计预防甚至治疗该神经病理状况的有效治疗策略。