抗PD-L1抗体功能化金属有机框架靶向递送PTPN2抑制剂经cGAS-STING激活增强头颈部鳞状细胞癌免疫治疗

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Anti-PD-L1 antibody-coated metal-organic framework for targeted PTPN2 Inhibitor delivery and enhanced immunotherapy of head and neck squamous cell carcinoma via cGAS-STING activation

　　

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种对免疫检查点阻断（ICB）反应有限的恶性肿瘤，原因在于肿瘤免疫原性不足和免疫抑制信号。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型（PTPN2）已被发现可负向调控抗肿瘤免疫反应。然而，PTPN2抑制剂的有效肿瘤靶向递送仍是一项重大挑战。在此，研究人员开发了一种抗PD-L1抗体功能化的Mn金属有机框架（MOF）纳米平台（Pi@MOF@aP）。锰基MOF核心可高效包封PTPN2抑制剂，并在酸性肿瘤微环境（TME）下实现pH响应性释放。抗PD-L1抗体表面修饰增强了肿瘤靶向性，促进了选择性细胞摄取，并提供了额外的免疫检查点阻断。Pi@MOF@aP对HNSCC细胞表现出强细胞毒性，同时与正常口腔角质形成细胞保持良好的相容性。机制上，Pi@MOF@aP介导的PTPN2抑制激活了cGAS-STING通路，增加了细胞因子产生，并增强了抗肿瘤免疫反应。在HNSCC小鼠模型中，Pi@MOF@aP实现了高效肿瘤蓄积，显著抑制肿瘤生长，延长生存期，并促进CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润，且无明显毒性。因此，本研究提出了一种多功能纳米治疗平台，整合了靶向PTPN2抑制、PD-L1阻断和cGAS-STING激活，为改善HNSCC免疫治疗疗效提供了一种有前景的策略。

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种高度侵袭性恶性肿瘤，尽管治疗取得进展，患者临床结局仍不理想。免疫检查点阻断（ICB）治疗已改变HNSCC治疗格局，Pembrolizumab和Nivolumab在HNSCC中显示生存获益，但仅一部分患者获得持久缓解。ICB疗效受限与细胞毒性T淋巴细胞浸润和活化不足以及代偿性免疫抑制信号相关，因此迫切需要能够同时提高肿瘤免疫原性并解除免疫抑制的策略。环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）通路是连接胞质DNA感知与抗肿瘤免疫的核心先天免疫信号轴。肿瘤细胞内在STING信号在HNSCC中常受损，导致先天免疫激活微弱和免疫治疗抵抗。蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型（PTPN2）近期被视为具有治疗潜力的细胞内免疫检查点，可负向调控细胞因子和T细胞受体（TCR）信号；PTPN2活性升高可减弱干扰素信号、降低肿瘤抗原呈递并抑制抗肿瘤免疫细胞活化。近期证据提示PTPN2上调是HNSCC中STING转录抑制的重要机制，药理抑制PTPN2可促进免疫细胞招募趋化因子产生并改善CD8⁺T细胞活性，提示PTPN2抑制可能解除干扰素信号与肿瘤内在DNA感知之间的关键阻断，从而促进由内源性肿瘤来源DNA触发的cGAS-STING通路激活。小分子PTPN2抑制剂AC484已在临床前模型中产生强抗肿瘤免疫，但PTPN2广泛参与免疫稳态，PTPN2抑制剂不受控制的全身暴露可能导致脱靶免疫激活；小分子PTPN2抑制剂的高效肿瘤递送还受非特异性生物分布、快速清除和正常免疫组织潜在暴露限制。因此，需要肿瘤靶向递送策略以提高瘤内药物蓄积并限制全身暴露。金属有机框架（MOF）由金属离子与有机配体配位构成，具有多孔结构、高载荷能力和可修饰外表面，可包封治疗分子并引入肿瘤靶向功能；纳米级MOF还可控降解，促进局部药物释放。抗PD-L1抗体修饰可能使纳米平台优先结合表达PD-L1的肿瘤细胞，同时破坏PD-1/PD-L1介导的免疫抑制。基于此，研究人员开发了抗PD-L1（aP）抗体包覆、包封PTPN2抑制剂（PTPN2i，Pi）的MOF纳米平台Pi@MOF@aP。MOF核心用于保护和运输PTPN2抑制剂，表面偶联抗PD-L1抗体用于靶向表达PD-L1的肿瘤细胞并提供局部免疫检查点阻断。肿瘤蓄积后，Pi@MOF@aP可释放PTPN2i并激活HNSCC的cGAS-STING信号；同时PD-L1阻断可防止活化细胞毒性T细胞受抑制并维持适应性抗肿瘤免疫。研究人员系统考察了Pi@MOF@aP的理化性质、载药行为、释放曲线、细胞摄取、治疗效果、生物分布、生物安全性和免疫调节作用，重点评价其激活cGAS-STING信号、重塑肿瘤免疫微环境和抑制HNSCC进展的能力。该研究结论是，该纳米平台整合主动肿瘤靶向、细胞内免疫检查点阻断和先天免疫激活，为HNSCC免疫治疗提供了潜在策略，具有重要意义。

关键技术方法概述（不超过250字）：以Mn-MOF装载PTPN2i，经SH-PEG-anti-PD-L1偶联构建Pi@MOF@aP；采用TEM、SEM、FTIR、XRD、DLS及HPLC-UV进行表征、载药与释放评价；以CCK-8、活/死染色、PD-1/PD-L1阻断ELISA、Nile Red标记摄取和ICP-AES检测Mn²⁺开展细胞研究；在C3H/HeN小鼠（购自Vital River Animal Technology）皮下SCCVII模型中评价抗肿瘤效果，并结合活体/离体荧光成像、H&E、免疫荧光、ELISA、流式细胞术、血清生化和血液学分析；HSC-3与HOK细胞购自ATCC。

研究结果如下：
3.1 Pi@MOF@aP的制备与表征（Preparation and characterization of Pi@MOF@aP）：通过TEM和SEM观察形貌，显示纳米颗粒呈纳米尺度、结构致密且表面粗糙；粒径分析显示平均直径115.2 ± 26.7 nm，多数分布于约80–160 nm；FTIR和XRD显示MOF框架相关特征吸收带及多衍射峰，晶型保持；DLS显示MOF、Pi@MOF、Pi@MOF@aP粒径逐步增加；在PBS、血清和培养基中72 h粒径几乎不变，胶体稳定性良好；PDI约0.3；Zeta电位显示MOF和Pi@MOF带正电，Pi@MOF@aP表面电位降低，提示抗体包覆成功。结论是成功制备具有纳米尺寸、稳定形貌、保持MOF结构、良好胶体稳定性和适于后续肿瘤靶向递送及免疫治疗表面特征的Pi@MOF@aP。

3.2 PTPN2i装载、释放及Pi@MOF@aP体外抗肿瘤活性（PTPN2i loading, release, and in vitro antitumor activity of Pi@MOF@aP）：通过HPLC-UV测定载药，随PTPN2i浓度增加载药量逐渐增加，包封效率下降，提示较高投药浓度下药物掺入接近饱和；Pi@MOF和Pi@MOF@aP在96 h内均呈持续释放，释放曲线相当，提示抗PD-L1抗体修饰未明显损害PTPN2i释放；pH 5.5条件下释放率高于中性pH，酸性条件释放最明显。CCK-8显示PTPN2i、Pi@MOF和Pi@MOF@aP在HSC-3细胞中浓度依赖性降低细胞活力，Pi@MOF@aP抑制活性强；相同制剂对HOK细胞毒性有限；活/死染色显示PTPN2i和Pi@MOF诱导明显红色荧光，Pi@MOF@aP死细胞信号最强，死细胞百分比显著增加；抗PD-L1和Pi@MOF@aP对PD-1/PD-L1抑制率超过90%。结论是Pi@MOF@aP具有良好载药能力、pH响应释放行为和有效体外抗肿瘤活性，并具备PD-L1阻断活性。

3.3 Pi@MOF@aP的细胞摄取和肿瘤靶向能力（Cellular uptake and tumor-targeting ability of Pi@MOF@aP）：采用Nile Red标记纳米颗粒，HOK细胞中Pi@MOF和Pi@MOF@aP红色荧光均较弱且无明显差异；HSC-3细胞中Pi@MOF@aP荧光强度显著高于Pi@MOF（P < 0.01）。ICP-AES检测细胞内Mn²⁺，HOK细胞中Mn²⁺水平低且两制剂无明显差异；HSC-3细胞中Pi@MOF@aP处理导致细胞内Mn²⁺浓度依赖性增加，并在较高浓度下显著高于Pi@MOF。体内荧光成像显示系统给药后荧光信号逐渐在肿瘤区域蓄积并可持续检测至24 h；离体成像显示肿瘤组织荧光最强，心、肝、脾、肺、肾信号较弱。结论是抗PD-L1功能化促进HNSCC细胞选择性摄取和体内肿瘤蓄积，Pi@MOF@aP具有选择性肿瘤细胞摄取和良好肿瘤靶向能力。

3.4 Pi@MOF@aP体内抗肿瘤疗效（In vivo antitumor efficacy of Pi@MOF@aP）：采用皮下HNSCC小鼠模型，荷瘤小鼠接受静脉治疗并在第14天处死分析。PBS组肿瘤快速生长，MOF组趋势相似，提示空白MOF载体单独抗肿瘤活性有限；MOF@aP中度延迟肿瘤进展；Pi@MOF一定程度抑制肿瘤生长；Pi@MOF@aP肿瘤生长抑制最强，肿瘤体积显著低于其他组，肿瘤重量最低；H&E染色支持Pi@MOF@aP强抗肿瘤作用；生存分析显示Pi@MOF@aP较对照组显著延长小鼠生存（P = 0.008）。结论是同时递送PTPN2i和抗PD-L1功能化较任一策略单独使用产生更明显治疗效果，Pi@MOF@aP有效抑制HNSCC肿瘤生长并改善生存。

3.5 Pi@MOF@aP生物安全性和生物分布评价（Biosafety and biodistribution evaluation of Pi@MOF@aP）：H&E染色显示肺、肝、脾、心、肾未见明显病理损伤；血清生化显示ALT、AST、ALB在各组间无显著差异；血液学分析显示RBC和WBC计数组间范围可比；BUN水平无明显差异。生物分布显示与Pi@MOF相比，Pi@MOF@aP显著提高肿瘤组织PTPN2i蓄积，而心、肝、肺、脾、肾中药物水平相对较低；时间依赖分析显示给药后瘤内PTPN2i蓄积增加，约4 h达较高水平，并逐渐保持至24 h。结论是Pi@MOF@aP具有良好系统生物安全性和增强的肿瘤PTPN2i蓄积，抗PD-L1抗体功能化增强肿瘤特异性药物递送并减少正常器官非特异性分布。

3.6 Pi@MOF@aP激活肿瘤组织cGAS-STING信号（Pi@MOF@aP activates cGAS-STING signaling in tumor tissues）：检测显示MOF基制剂处理后cGAMP相对水平增加，提示纳米平台促进STING激活所需第二信使cGAMP生成。免疫荧光显示PBS、MOF和MOF@aP组PTPN2信号明显，Pi@MOF和Pi@MOF@aP显著降低PTPN2表达（P < 0.01）；siRNA敲低PTPN2后，与siNC组相比，cGAS和pSTING水平显著增加。免疫荧光显示Pi@MOF和Pi@MOF@aP较PBS、MOF和MOF@aP显著增强cGAS荧光强度（P < 0.05），pSTING染色也明显增强，且Pi@MOF和Pi@MOF@aP的pSTING强于MOF和MOF@aP。机制上，肿瘤蓄积和细胞摄取后Pi@MOF@aP释放PTPN2i和Mn²⁺，Mn²⁺促进cGAMP产生并增加pSTING，PTPN2i抑制PTPN2并增加cGAS和pSTING。结论是Pi@MOF@aP有效激活肿瘤组织cGAS-STING信号，为其增强HNSCC治疗效果提供机制基础。

3.7 Pi@MOF@aP增强抗肿瘤免疫激活（Pi@MOF@aP enhances antitumor immune activation）：ELISA检测肿瘤组织免疫相关细胞因子，PBS、MOF和MOF@aP中度增加IFN-β和CXCL10，Pi@MOF和Pi@MOF@aP诱导更强增加；TNF-α和IL-6在Pi@MOF和Pi@MOF@aP处理后升高；脾重作为系统免疫激活指标，MOF@aP、Pi@MOF和Pi@MOF@aP增加脾重，Pi@MOF@aP最高；IFN-γ在MOF@aP、Pi@MOF和Pi@MOF@aP后显著增加，Pi@MOF@aP诱导最强；流式分析显示MOF@aP和Pi@MOF较PBS和MOF增加CD4⁺和CD8⁺T细胞比例，Pi@MOF@aP最高。结论是Pi@MOF@aP有效增强先天免疫激活、促进炎症细胞因子分泌并增加抗肿瘤T细胞反应，从而贡献其优越的抗HNSCC疗效。

讨论部分总结：实验模型中PD-L1靶向递送、PTPN2抑制和免疫激活的一致增强为在不同HNSCC亚型中进一步评价提供基础；仍需额外HNSCC模型和患者来源肿瘤系统验证Pi@MOF@aP纳米平台的广泛适用性。研究承认若干局限：皮下SCCVII肿瘤模型可可靠评价系统抗肿瘤免疫和治疗反应，但小鼠与人免疫系统差异可能影响转化相关性；未来需要原位HNSCC模型、人源化免疫系统模型或患者来源肿瘤模型进一步验证临床适用性；当前发现提供重要概念验证证据。研究结论翻译：在本研究中，研究人员开发了一种抗PD-L1抗体功能化的Mn金属有机框架（MOF）纳米平台（Pi@MOF@aP），用于靶向递送PTPN2抑制剂（PTPN2i）并增强HNSCC免疫治疗。所构建的纳米平台表现出良好的理化性质、高效的PTPN2i装载和pH响应性药物释放行为。通过抗PD-L1介导的肿瘤靶向，Pi@MOF@aP促进了HNSCC细胞对纳米颗粒的选择性摄取，并增加了瘤内蓄积，同时保持良好的生物安全性。机制上，Pi@MOF@aP抑制PTPN2表达并促进cGAS-STING通路激活，导致细胞因子产生增强和抗肿瘤免疫反应改善。同时，表面偶联的抗PD-L1抗体通过破坏PD-1/PD-L1相互作用并促进T细胞活化，提供了额外的免疫检查点阻断。在体外和体内模型中，Pi@MOF@aP与单一治疗策略相比表现出更优的抗肿瘤疗效，并伴随CD8⁺T细胞浸润增加和免疫微环境重塑。总体而言，本研究提出了一种多功能MOF基免疫治疗平台，整合了靶向药物递送、细胞内免疫检查点调控和先天免疫激活，为改善HNSCC免疫治疗结局提供了一种有前景的策略。