《Frontiers in Microbiology》：Antibacterial efficacy and mechanism of action of VTC3-knockout Saccharomyces cerevisiae against multidrug- resistant pathogenic bacteria
编辑推荐：
引言：多重耐药（MDR）细菌感染是全球公共卫生危机，传统抗生素治疗正日益失效。益生菌在此背景下是一种有前景的策略。方法：本研究考察了VTC3基因敲除（VTC3-KO）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的抗菌活性及作用机制。结果：生长曲
引言：多重耐药（MDR）细菌感染是全球公共卫生危机，传统抗生素治疗正日益失效。益生菌在此背景下是一种有前景的策略。方法：本研究考察了VTC3基因敲除（VTC3-KO）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的抗菌活性及作用机制。结果：生长曲线、生物膜形成、抗菌谱和共培养实验表明，VTC3-KO酿酒酵母有效抑制病原菌生长，并显著抑制大肠埃希菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的生物膜形成。此外，VTC3-KO酿酒酵母对胃肠道环境具有耐受性，并增强与病原菌的自身聚集和共聚集。在大蜡螟（Galleria mellonella）体内培养和小鼠感染模型中，VTC3-KO酿酒酵母显著提高宿主存活率，减轻肠道组织损伤，并减少炎症细胞浸润。讨论：机制研究提示，观察到的抗菌效应可能归因于酸性物质的产生。这些发现表明，VTC3-KO酿酒酵母具有抗菌和益生双重功能，为治疗MDR感染提供可持续的传统抗生素替代方案。
多重耐药（MDR）细菌感染已成为全球公共卫生危机。2021年全球归因于MDR感染的死亡人数达471万，预计2030年全球国内生产总值年损失为1–3.4万亿美元，2050年相关医疗成本将再增加1万亿美元。国内监测数据亦显示，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、碳青霉烯耐药肠杆菌和碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（A. baumannii）等临床常见MDR菌耐药率持续较高，2024年A. baumannii对碳青霉烯类耐药率仍高于64%。MDR菌耐药机制复杂多样，包括基因突变、水平基因转移和生物膜形成，导致传统抗生素疗效明显下降；增加剂量或联合用药虽可暂时控制感染，但常带来不良反应、继发和交叉感染，并显著增加死亡率和医疗成本。尽管联合治疗和新型抗生素研发有所进展，耐药困境仍未解决，且存在成本高、安全性有限等问题。因此，开发安全、有效且不易诱导耐药的非抗生素干预措施十分关键。益生菌可通过调节宿主免疫、抑制病原菌定植和修复肠道屏障等途径对抗MDR感染；与传统乳酸菌相比，酵母具有更强环境耐受性、分泌多种酶的能力及独特细胞壁葡聚糖结构，在抑制病原菌、改善炎症和治疗抗生素相关性腹泻方面显示较优益生潜力。部分酿酒酵母（S. cerevisiae）可通过分泌有机酸和抗氧化物质抑制病原菌生长并干扰生物膜形成，其靶点不同于传统抗生素，可能规避细菌耐药。基因工程改造S. cerevisiae已成为发掘增强抗菌活性菌株的有效策略。前期研究显示，靶向敲除BTS-1和TAD-1可显著增强酵母抗病原菌作用。在此基础上，研究人员进一步靶向VTC3，该基因编码参与多聚磷酸盐（PolyP）合成和转运的液泡膜转运蛋白；PolyP在微生物应激反应、毒力调控和生物膜形成中发挥关键作用，提示VTC3/PolyP通路可能与酵母抗菌功能密切相关。然而，VTC3敲除对S. cerevisiae抗菌活性尤其是对临床MDR菌的影响及其分子机制尚鲜有报道。因此，本研究旨在考察VTC3-KO S. cerevisiae的体外和体内抗菌活性及益生潜力，阐明其抗MDR菌的潜在机制，为开发新型酵母益生制剂和临床抗感染治疗提供实验依据和理论基础。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员以VTC3-KO S. cerevisiae、亲本BY4743和布拉氏酵母（S. boulardii）CNCM I-745为对象，制备无细胞上清液（CFS），开展生长曲线、抗菌谱（11株，含临床MDR分离株）、结晶紫（CV）生物膜抑制、黏附/疏水性/胞外多糖（EPS）、酵母–细菌共培养、模拟胃肠液耐受及自聚集/共聚集实验；采用大蜡螟（G. mellonella）感染模型和鼠伤寒沙门菌（S. typhimurium）SL1344诱导的无特定病原体（SPF）级雄性C57BL/6J小鼠肠炎模型（江苏集萃药康，许可证SCXK（苏）2018-0008、SYXK（苏）2020-0048），结合实时定量PCR（qPCR）和苏木精–伊红（H&E）染色；并用非靶向液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）代谢组及pH、酶、热处理鉴定活性成分。
结果：3.1 敲除VTC3不显著影响S. cerevisiae增殖。通过24 h生长曲线观察到VTC3-KO与BY4743生长曲线几乎一致，提示标准实验室条件下无显著生长缺陷。3.2 VTC3-KO S. cerevisiae CFS抑制E. coli、S. aureus和K. pneumoniae生长。通过生长曲线发现90%（v/v）CFS显著延迟从延滞期向对数期转换、降低最大比生长速率（μ
max）和总菌数，且灭菌水与YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖）对照无显著差异，提示抗菌效应源于生物活性代谢物而非碳氮源耗竭。3.3 VTC3-KO CFS抑制多种病原菌生长。通过11株抑制实验发现其对革兰阴性菌、革兰阳性菌及临床MDR分离株（MRSA、K. pneumoniae ATCC700603、A. baumannii 21-1）具有活性，且显著强于BY4743和S. boulardii CFS。3.4 VTC3-KO CFS抑制生物膜形成。通过CV染色显示25%、50%、90%（v/v）CFS剂量依赖性抑制E. coli ATCC25922、E. coli（mcr-1）、S. aureus ATCC29213、MRSA和K. pneumoniae 700603生物膜，90%（v/v）抑制率分别为86.31%、85.29%、83.61%、87.44%和83.05%。3.5 VTC3-KO CFS降低E. coli ATCC25922和S. aureus ATCC29213黏附、疏水性和EPS产生。通过相应实验显示50%（v/v）CFS使黏附能力分别下降29.45%和37.89%，疏水性下降13.05%和16.28%，EPS产生下降22.61%和16.57%。3.6 VTC3-KO S. cerevisiae抑制病原菌生长。通过酵母–细菌共培养模型发现活VTC3-KO酵母在16 h和24 h显著降低E. coli ATCC25922、S. aureus ATCC29213和K. pneumoniae ATCC700603菌数，16 h抑制率分别为48.44%、89.88%和45.77%，24 h仍维持相近抑制，H
2O与YPD组间无显著差异。3.7 VTC3-KO S. cerevisiae具有优良益生特性。3.7.1 对模拟胃肠液耐受良好：模拟胃液（pH 3.0）1 h存活率82.13%，3 h仍高于75%；含0.3%胆盐模拟肠液4 h存活率65.17%。3.7.2 自聚集和与病原菌共聚集增强：自聚集较BY4743提高16.48%，与E. coli和S. aureus共聚集分别提高26.31%和15.4%。3.8 VTC3-KO S. cerevisiae的体内抗菌治疗作用。3.8.1 延长G. mellonella存活：活酵母、热灭活酵母或CFS对健康幼虫5 d存活无显著影响，提示低毒性；感染模型中活酵母和CFS显著延长E. coli或S. aureus感染幼虫存活并降低菌载，热灭活酵母无保护作用。3.8.2 保护S. typhimurium诱导的小鼠肠炎：7 d安全性试验显示体重增长与0.9%盐水组相近；感染后VTC3-KO显著减轻体重下降、提高10 d存活率，减轻脾肿大、结肠缩短和盲肠充血，降低回肠、结肠和盲肠菌载；qPCR显示下调IL-6和TNF-α、上调IL-10，并上调occludin、claudin-1和ZO-1；H&E显示绒毛结构完整、组织水肿和炎性细胞浸润减少。3.9 代谢组分析显示CFS中具抗菌活性的代谢物主要为有机酸。通过非靶向LC-MS/MS发现VTC3-KO与BY4743 CFS代谢谱明显分离，主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型可靠；人类代谢组数据库（HMDB）注释的165个显著差异代谢物中有机酸及衍生物占64.71%；火山图筛选369个显著差异代谢物（135个上调、234个下调），上调者多为有机酸，包括乳清酸、二氢乳清酸、脲基琥珀酸、苯丙酮酸和D-3-苯乳酸等；京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集显示氨基酸代谢、嘧啶代谢、氨酰tRNA生物合成、烟酸/烟酰胺代谢和ABC转运通路显著富集，D-氨基酸代谢高富集，其α-酮酸产物可进入三羧酸（TCA）循环和糖异生。作者总结认为VTC3敲除可重塑碳代谢通量，使其向有机酸生物合成途径偏移。3.10 VTC3-KO S. cerevisiae通过产生活性代谢物发挥抗菌作用。通过pH中和、酶处理和热处理发现其CFS抗菌活性呈pH依赖，pH 2–4抑制明显，pH 6–8减弱或消失；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理不显著改变活性，提示活性物质非蛋白类；60℃、80℃甚至100℃处理1 h后活性基本稳定，提示热稳定性小分子有机酸类特征。
讨论部分总结：讨论指出，生物膜介导的持续感染和MDR菌持续肠道定植是抗感染失败和复发的重要驱动因素；传统抗生素在杀菌同时可破坏肠道微生态并促进耐药株选择。益生菌通过调节免疫、竞争生态位和分泌活性代谢物提供新策略，酵母对胃酸和胆盐耐受性较高且不被多数临床抗生素抑制，具联合应用潜力。该研究首次系统考察VTC3-KO S. cerevisiae的抗菌活性及机制；VTC3主要参与液泡PolyP合成和转运，并非直接参与有机酸生物合成，作者提出假设认为磷酸盐–PolyP信号网络可能作为间接调控节点重塑全球碳代谢通量，为抗菌酵母代谢工程提供不同于常规碳代谢靶点的新视角。CFS以剂量依赖方式抑制革兰阳性、革兰阴性及MDR菌生物膜，并主要干扰生物膜发育早期黏附步骤；但未评价对成熟生物膜的清除能力，且生物膜和毒力实验未设BY4743 CFS平行对照。VTC3-KO菌株对模拟胃肠液耐受良好，自聚集和共聚集增强，有利于建立空间屏障并局部释放抗菌代谢物；但静态实验不能反映肠道动态定植。活酵母–病原菌共培养证实活菌可直接抑制病原菌增殖。G. mellonella和鼠肠炎模型显示活酵母及CFS提高感染宿主存活率并降低体内菌载，热灭活酵母无保护作用，提示体内保护依赖活细胞代谢和分泌活动而非酵母细胞结构成分；小鼠模型中VTC3-KO减轻脾肿大、结肠缩短和充血，降低肠道菌载，下调IL-6和TNF-α、上调IL-10，并上调occludin、claudin-1和ZO-1，H&E显示肠绒毛完整和炎性浸润减少，提示其既直接抑制病原菌增殖和定植，又调节宿主炎症反应并保护肠上皮屏障。讨论还指出，CFS抗菌活性呈pH依赖、非蛋白、热稳定，与有机酸类小分子性质一致；代谢组显示有机酸及衍生物显著上调，D-氨基酸代谢途径富集，α-酮酸进入TCA循环连接碳代谢通量与产酸过程。局限性包括：未纯化单个活性分子、未验证特定代谢物因果作用及长期耐药发展、未评估生理pH下稳定性和疗效、体外为单病原培养、体内为预防性给药模型且缺乏定植动态和易位风险数据、未设同时间培养YPD空白对照、长期安全性/慢性毒性/免疫原性/水平基因转移/遗传稳定性及有效剂量窗口尚待确定。
研究结论翻译：总之，本研究表明，VTC3基因敲除赋予酿酒酵母体外和体内优异的抗病原能力和益生特性。体外实验验证，VTC3-KO酵母来源的CFS对MDR病原菌具有广谱抑制作用，以剂量依赖方式抑制生物膜形成，并降低细菌黏附、细胞表面疏水性和EPS产生。VTC3-KO菌株对胃肠道应激具有强耐受性，并显著增强自聚集和共聚集能力。此外，大蜡螟和S. typhimurium诱导肠炎小鼠模型验证了其体内保护功能，包括提高宿主存活率、降低肠道组织细菌负荷、减轻肠道炎症损伤和保持肠道屏障完整性。尽管有这些发现，在实际临床应用前仍有若干科学挑战需要解决。未来研究将聚焦核心活性物质的分离鉴定、VTC3介导碳代谢重塑的分子调控网络解析、复杂肠道菌群条件下的功能验证以及工程菌株生物安全性的系统评价。
