多柔比星诱导的基质重塑CD8+ T细胞（mxT-cells）通过LOX驱动心脏细胞外基质病理性重塑

《JACC: CardioOncology》：Fibrotic Rewiring of CD8+ T Cells by Doxorubicin Drives Pathological Remodeling of Cardiac Extracellular Matrix

　　

背景：蒽环类化疗可导致心脏毒性和慢性心力衰竭，目前尚无特异性预防治疗。因此，需开展机制研究以开发心脏保护策略。研究人员既往发现，蒽环类药物多柔比星可引发心脏趋向性CD8⁺ T细胞反应，该反应促进心脏成纤维细胞转化、纤维化和慢性心脏毒性。然而，T细胞诱导纤维化的确切分子机制以及T细胞能否直接诱导心脏重塑仍不清楚。目的：研究人员旨在研究接受蒽环类药物治疗患者、小鼠及培养T细胞的T细胞转录组，以更好理解T细胞在跨物种多柔比星治疗中影响不良心脏重塑的机制。方法：研究人员将接受蒽环类药物治疗前或治疗后3个月的患者循环CD8⁺ T细胞的批量RNA测序（bulk RNA sequencing）与多柔比星或PBS处理小鼠心脏CD8⁺ T细胞的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）相结合。原代小鼠T细胞在体外经多柔比星处理用于分子机制研究，并对心脏细胞外基质（extracellular matrix, ECM）进行离体机械表征。结果：蒽环类药物治疗在人和小鼠CD8⁺ T细胞中诱导以ECM及ECM交联蛋白高表达为特征的新促纤维化特征，研究人员将其称为“基质重塑T细胞”（matrix remodeling T cells, mxT-cells）。心脏ECM的功能性机械测试显示，mxT-cells通过T细胞赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX）活性使心脏ECM变硬。机制上，多柔比星激活mxT-cells中的HIF1α-P53信号，诱导自分泌转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGFβ1），进而增强LOX并导致ECM交联和心脏硬度升高。结论：研究人员数据表明，多柔比星在CD8⁺ T细胞中赋予一种新的内在促纤维化功能，该功能负责ECM交联、纤维化和心脏重塑。

蒽环类（anthracycline，一类化疗药物）治疗可有效治疗癌症患者，但受剂量依赖性心脏毒性限制，常导致慢性心力衰竭（heart failure, HF）。患者可出现收缩功能障碍、炎症和心脏纤维化等与其他病因HF相似的表现，但标准HF治疗预防该类心脏毒性疗效有限，其机制仍不清楚。除中性粒细胞和巨噬细胞活化等先天免疫反应外，研究人员所在团队既往发现多柔比星（doxorubicin，蒽环类化疗药）可诱导心脏CD8⁺ T细胞（一种细胞毒性T淋巴细胞）反应，该反应在人类、犬和小鼠中保守，并为收缩功能障碍、纤维化和慢性HF所需。既往研究显示，体内和体外多柔比星处理的细胞毒性CD8⁺ T细胞上调IFNγ表达和细胞毒性颗粒酶脱颗粒，促进促纤维化成纤维细胞转化和心脏纤维化；多柔比星可直接作用于成纤维细胞并诱导其活化，使其与细胞毒性T细胞相互作用。心脏纤维化和心室重塑不仅受细胞外基质（extracellular matrix, ECM，细胞外结构网络）沉积调控，也受胶原交联酶如赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase, LOX，催化胶原交联的酶）调控。CD8⁺ T细胞来源的赖氨酰氧化作用可通过ECM重塑促进紫杉醇化疗后的肺转移龛形成，提示CD8⁺ T细胞可能参与更复杂的纤维化机制。研究人员提出假说：多柔比星触发CD8⁺ T细胞的促炎和促纤维化重编程，导致心脏硬度增强。该研究发表于《JACC: CardioOncology》。作者为 Abraham L. Bayer、Ramona Emig、Celina Kley、Maria Antonia Zambrano、Zachary L. Robbe、Jose Max Narvaez-Paliza、Sanam Alilou、Sarah Powers、Jenica N. Upshaw、Aarti Asnani、Pilar Alcaide。研究旨在通过患者CD8⁺ T细胞批量RNA测序、小鼠心脏单细胞转录组及体内外多柔比星处理，证明多柔比星上调CD8⁺ T细胞中包括LOX家族成员LOX在内的ECM重塑酶，并将此类细胞称为“基质重塑T细胞”（matrix remodeling T cells, mxT-cells）；进一步发现多柔比星通过HIF1α-P53-TGFβ信号轴直接诱导LOX表达，导致心脏ECM僵硬化，从而揭示多柔比星诱导纤维化的新免疫调控机制及化疗所致ECM重塑免疫调节的新范式。关键技术方法包括：多中心观察队列（Beth Israel Deaconess Medical Center与Tufts Medical Center，2024—2025年，成人恶性肿瘤接受蒽环类治疗，分发现与验证队列）治疗前及3个月外周血CD8⁺ T细胞批量RNA测序；公共心脏单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq，在单细胞核水平检测转录组）数据分析；多柔比星或PBS处理小鼠心脏CD45⁺非心肌细胞的细胞转录组和表位测序（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing, CITE-seq，同时检测转录本和表面蛋白）；小鼠多柔比星4或8周模型、超声心动图、脱细胞心脏ECM（decellularized ECM, dECM，去除细胞后的ECM支架）单轴拉伸测试；原代小鼠Tc1细胞（1型细胞毒性T细胞）体外多柔比星处理及条件培养基处理dECM；结合RT-qPCR、Western blot、流式细胞术及BAPN（β-aminopropionitrile，泛LOX抑制剂）、TGFβ中和抗体、echinomycin（HIF1α抑制剂）和nutlin-3（P53激活剂）等干预。研究结果如下。蒽环类治疗在人细胞毒性T细胞中诱导促纤维化转录谱：通过患者治疗前后CD8⁺ T细胞批量RNA测序，鉴定1,416个差异表达基因，上调基因富集于胶原形成、ECM组织和整合素表面相互作用，并验证LOX、MMP9和COL1A1表达升高，提示人循环CD8⁺ T细胞获得ECM重塑能力。患者和小鼠蒽环类治疗诱导与传统活化Tc1细胞不同的特异性基质重塑T细胞（mxT-cells）：通过公共心脏snRNA-seq比较健康供者与多柔比星心肌病（DR-CM）患者，发现DR-CM心脏T细胞中LOXL1、COL1A1及mx评分升高；通过小鼠心脏CITE-seq发现多柔比星诱导心脏CD8⁺ T细胞Lox、Loxl1、Mmp9及mx评分升高，并鉴定9个CD8⁺ T细胞亚群，将mx评分阳性者定义为mxT-cells；该类细胞胶原和ECM相关基因较高、T细胞活化和蛋白翻译相关基因较低，Cd69和Ifng表达较低，区别于传统高活化IFNγ表达T细胞。小鼠多柔比星治疗导致脾脏和循环细胞毒性T细胞纤维化基因表达增加及心脏ECM硬度升高：通过4或8周多柔比星模型，发现左心室射血分数进行性下降、dECM硬度进行性增加，且ECM硬度与射血分数相关；脾脏和循环CD8⁺ T细胞Lox、Loxl1、Mmp9 mRNA及LOX蛋白升高，脾脏CD8⁺ T细胞Lox与ECM硬度相关；心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFB，心脏基质主要产生细胞）中LOX⁺细胞数量增加但每细胞平均表达未变。小鼠细胞毒性T细胞多柔比星处理上调胶原修饰酶并诱导LOX依赖性ECM僵硬化：通过体外多柔比星处理Tc1细胞，发现Lox、Loxl1、Mmp9、Mmp13和Col1a1表达升高，约35 kDa活性LOX片段增加；多柔比星处理Tc1条件培养基使dECM硬度增加2.2倍，BAPN完全阻断该效应；抑制IFNγ不影响上述基因，CFB体外多柔比星处理不诱导Lox或Loxl1。多柔比星通过自分泌TGFβ1依赖机制诱导CD8⁺ T细胞LOX表达：通过人和小鼠测序数据预测TGFβ/SMAD通路，发现患者CD8⁺ T细胞TGFB1、小鼠循环CD8⁺ T细胞Tgfb1升高，心脏和脾脏CD8⁺ T细胞p-SMAD2（磷酸化SMAD2）升高；重组TGFβ1可上调Tc1细胞Lox、Loxl1、Mmp9和Mmp13；TGFβ中和抗体降低多柔比星诱导的LOX RNA和蛋白，并消除条件培养基所致dECM硬化；自分泌TGFβ1不改变已分化Tc1细胞Foxp3、Tbx21或Rorc表达。多柔比星通过HIF1α-P53信号诱导TGFβ1表达和LOX依赖性ECM僵硬化：通过通路分析和时间进程，发现多柔比星依次激活HIF1α、P53和SMAD2，HIF1α蛋白在1—4小时升高后下降，P53磷酸化在4—8小时出现，SMAD2磷酸化在8—24小时升高；体内心脏CD8⁺ T细胞p-P53⁺增加；echinomycin抑制HIF1α降低Tgfb1、Mmp9和LOX表达及条件培养基所致dECM硬化；nutlin-3激活P53可在HIF1α抑制背景下回复LOX表达和dECM硬化。讨论部分总结：经典观点认为CFB是稳态和病理性纤维化中ECM的主要产生和重塑细胞，并可通过炎症触发及招募免疫细胞参与纤维化；既往研究显示多柔比星后成纤维细胞帮助招募细胞毒性T细胞，T细胞与CFB接触及脱颗粒触发肌成纤维细胞转化。该研究提示mxT-cells可不依赖CFB直接产生LOX并使心脏ECM变硬，补充分泌颗粒酶B等激活CFB的机制；多柔比星体外不直接诱导CFB Lox mRNA，提示体内CFB LOX诱导可能通过T细胞—CFB相互作用等不同机制。讨论指出，T细胞LOX、T细胞介导CFB活化及其他纤维化因素对体内ECM硬化的相对贡献仍需研究；所用抑制剂抑制所有LOX家族成员，各酶贡献未知；TGFβ未改变已分化Tc1极化；mxT-cells低表达Cd69和Ifng，与高活化IFNγ表达T细胞不同，其与调节性T细胞关系尚不明确；多柔比星可增加活性氧（reactive oxygen species, ROS），但ROS与T细胞HIF1α激活的确切联系未证实；TGFβ可自分泌或旁分泌作用于CFB，ECM硬度本身也可驱动CFB促纤维化转化；未来需研究LOX抑制是否保护心肌ECM僵硬并改善心功能。研究限制包括非荷瘤小鼠、患者样本量小、仅单一时间点，以及mxT-cell来源LOX对ECM硬化和HF进展的具体功能贡献尚需研究，LOX抑制长期安全性亦需进一步评估。研究结论翻译：针对蒽环类诱导的HF，目前缺乏广泛有效且特异的治疗策略，部分原因在于研究人员对该疾病中新近受到关注的心脏细胞类型的分子机制及其作用理解尚不完整。本研究工作显示，在接受蒽环类药物治疗的癌症患者和多柔比星处理小鼠中存在一种保守机制，即细胞毒性T细胞通过HIF1α-P53-TGFβ1信号被重编程为mxT-cells。这些mxT-cells以促纤维化转录程序为特征，涉及ECM交联酶LOX的高表达。重要的是，研究人员提供证据表明，mxT-cells来源的LOX足以在体外增加ECM硬度，并与体内ECM硬度和收缩功能障碍相关。总之，这些数据强调mxT-cells在接受蒽环类药物治疗患者的不良心脏重塑中的重要性，并提示一种具有治疗干预潜力的新纤维化机制。