《Frontiers in Immunology》：Nanotechnology for next-generation CAR T-Cell manufacturing
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嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗格局；然而，其更广泛的临床应用仍受制于当前制造流程的复杂性、高昂成本及批次间变异性。传统CAR T细胞生产依赖多步骤体外（ex vivo）流程，包括T细胞激活、基因工程改造、扩增及质量控制，其中
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗格局；然而，其更广泛的临床应用仍受制于当前制造流程的复杂性、高昂成本及批次间变异性。传统CAR T细胞生产依赖多步骤体外（ex vivo）流程，包括T细胞激活、基因工程改造、扩增及质量控制，其中每一步均影响最终细胞产品的表型、持久性与治疗效力。越来越多的证据表明，制造过程不仅仅是后勤流程，更是决定CAR T细胞功能的关键生物学因素。因此，该领域正经历概念性转变，从最大化扩增和转导效率转向主动工程化具有治疗优势的细胞状态。纳米技术与生物材料工程的最新进展，通过对调控T细胞行为的生化、空间及力学线索进行精确控制，为应对上述挑战提供了前所未有的机遇。本综述围绕完整的CAR T细胞制造管线，探讨了新兴的纳米技术赋能策略。综述审视了利用基底刚度、形貌、配体组织及力学生物学信号来调节T细胞激活、分化与耗竭的工程化激活平台；进一步讨论了基于纳米技术改善病毒转导及通过脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）、纳米结构化界面和胞内递送系统实现非病毒CAR递送的策略；随后重点介绍了旨在保留干细胞样和记忆表型的扩增微环境工程策略，以及可能完全绕过传统体外制造的体内（in vivo）CAR生成策略。最后，本综述聚焦于能够实现制造实时监测、质量控制及自适应过程优化的纳米级生物传感与分析平台。总而言之，这些进展将纳米技术定位为实现下一代CAR T细胞制造的变革性平台。
1 引言
CAR T细胞疗法作为过继性细胞治疗的一种变革性模式，已在复发/难治性血液恶性肿瘤中展现出前所未有的临床疗效。CAR作为合成受体，能以不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的方式将T细胞重定向至肿瘤相关抗原，实现强效且特异性的肿瘤杀伤。第一代CAR由胞外抗原识别域（常见为单链可变区片段，scFv）、铰链区、跨膜区及胞内信号域组成。共刺激域（如CD28或4-1BB）的引入显著改善了CAR T细胞的扩增、持久性、代谢及长期抗肿瘤活性。目前，CAR通常依据胞内信号模块分为五代：第一代仅含CD3ζ，第二代将CD3ζ与单一共刺激域（如CD28或4-1BB）结合，第三代含两个共刺激域，第四代在第二代骨架上偶联可诱导载荷（如细胞因子分泌），第五代则引入基于IL-2Rβ/STAT3/5的细胞因子受体信号模块，提供抗原触发的JAK-STAT信号。
尽管CAR T细胞疗法在血液肿瘤中取得了最大成功，但其在实体瘤中的疗效仍显著不足。肿瘤异质性、抗原逃逸、免疫抑制性肿瘤微环境及CAR T细胞持久性受限等问题持续制约着持久缓解。越来越多的证据表明，治疗效力不仅由CAR设计本身决定，还受输注前T细胞生物学状态的影响。CAR T细胞作为“活体药物”，其表型、代谢适应性、分化状态及功能持久性深受体外制造过程影响。因此，CAR T细胞制造已从纯后勤流程演变为治疗效能与临床结果的关键决定因素。
当前获批产品的制造流程大体相似，均涉及白细胞分离术、T细胞激活、基因工程改造、扩增和冻存。每一步均引入了影响最终产品质量、一致性与效力的独特生物学和工程挑战。此外，现有制造方法劳动密集、高度个体化、静脉到静脉时间长、成本高昂、存在制造失败风险且可扩展性有限。
白细胞分离术后，分离的T细胞通常使用抗CD3/CD28抗体包被磁珠或人工抗原提呈系统进行体外激活。强T细胞受体（TCR）介导的激活虽为基因转移所需，但也会驱动T细胞从初始/干细胞样状态向终末分化表型转变。分化细胞虽具强短期细胞毒性，但输注后常表现持久性受损、增殖能力下降及耗竭易感性增加。基因改造最常使用慢病毒或γ-逆转录病毒载体实现稳定整合，但病毒生产复杂、成本高且存在调节负担。非病毒方法（如电穿孔mRNA递送、转座子系统）虽可简化制造，仍受限于瞬时表达或递送效率。扩增阶段虽为临床剂量所需，但长时间培养会驱动分化、代谢应激和耗竭表型，损害长期抗肿瘤效力。冻存步骤亦影响细胞活力与功能恢复。
纳米技术与纳米材料工程的最新进展为应对上述制造瓶颈提供了新机遇。纳米级工具能够精确控制尺寸从数纳米至微米级的生物对象（如生物分子、病毒、细胞器及细胞丝足），实现对黏附、迁移、增殖、分化及死亡等基本细胞功能的空前调控。在CAR T细胞工程领域，纳米技术平台可精确调控激活、基因递送、扩增与分化所涉及的生化、力学及空间线索。
本综述以CAR T细胞制造本身为核心组织框架，而非将纳米技术视为已工程化T细胞治疗活性的辅助手段。综述重点考察纳米材料如何在CAR T细胞生产的各主要阶段——从激活、基因工程改造、扩增、体内生成到制造监测与质量控制——进行干预。特别强调工程化材料不仅控制常规制造指标（如细胞产量和转导效率），还控制最终细胞产品的生物学质量，包括激活强度、分化状态、耗竭程度、记忆表型、代谢适应性、持久性及最终治疗效力（Box 1）。纳米尺度的生化组织、形貌、刚度、黏弹性及其他物理线索被视为可编程的制造参数，而非单纯的材料属性。
2 体外T细胞激活的纳米技术
2.1 体外T细胞激活——当前技术现状
体外激活是CAR T细胞制造的门控步骤，使T细胞对基因修饰易感、启动临床级别数量的增殖，并建立最终治疗产品的功能状态。激活信号的强度、持续时间和环境深刻影响T细胞分化、耗竭、代谢适应性及体内长期持久性。所有现有激活平台均旨在模拟体内T细胞激活，即触发TCR/CD3复合物（信号1）和共刺激CD28受体（信号2）。与体内由抗原提呈细胞（APC）或靶细胞上天然配体触发不同，体外激活依赖针对这些受体的抗体，并将抗体固定于固相支持物（如磁珠、四聚体复合物或人工APC）。抗体与受体亲和力比pMHC-TCR高数个数量级，因此无法实现配体串行触发机制，激活所需抗体数量远高于配体。此外，激活分子必须锚定于固相载体，可溶性抗体激活效率有限。商业化的Dynabeads?为4.5微米聚苯乙烯/氧化铁核壳磁珠，可通过磁性分离去除。较新的可移除或可降解纳米级激活基质（如T Cell TransAct?）为约100 nm的胶体纳米基质，含纳米氧化铁晶体和多糖基质，偶联激动性抗CD3/CD28抗体，可通过常规换液去除，适用于封闭自动化制造。
2.2 激活环境的物理参数作用
体内T细胞环境具有高度力学多样性。T细胞具备机械传感机制，用于区分靶细胞与健康组织。配体支持表面的弹性显著影响T细胞响应，且该响应为双相性——在生理相关中间刚度处激活最强。形貌方面，T细胞通过富含肌动蛋白的微绒毛（纳米级突起）与靶细胞相互作用，微绒毛尖端富集TCR及近端信号分子，其高局部曲率被认为可促进CD45磷酸酶从微绒毛尖端分离，提高T细胞敏感性。纳米级表面形貌本身即可诱导膜突起并产生一定程度的T细胞激活，机制可能涉及膜曲率诱导的TCR-CD45分离。配体组成与空间组织方面，体内配体在靶细胞表面弥散分布，与TCR结合后形成动态纳米簇（约200–500 nm），进而成熟为免疫突触，包括中央超分子激活簇（cSMAC）、外周SMAC（pSMAC，含LFA-1/ICAM-1黏附环）和远端SMAC（dSMAC，含CD45和CD43）。体外研究表明，配体表面密度、间距、TCR内化/再循环及簇集均可独立调节T细胞响应。理想激活平台需平衡以下因素：(i) 足够高的激活水平以保证转导效率和增殖；(ii) 低耗竭；(iii) 向持久抗肿瘤相关表型的定向分化。
2.3 调节T细胞力学刺激的纳米材料平台
基于聚丙烯酰胺（polyacrylamide）的水凝胶可通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺交联剂比例，在约10 Pa至200 kPa范围内调控弹性模量，增强基底刚度可增强T细胞激活和早期信号。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）可在更高模量范围内观察到激活-刚度关系反转，提示双相响应。弹性PDMS微珠可作为刚性Dynabeads的替代品进行力学刺激性T细胞激活。电纺聚(ε-己内酯)纤维经PDMS软化后，可增强人CD4+和CD8+ T细胞扩增并恢复CLL患者低响应T细胞的增殖反应。具有可调弹性的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）水凝胶支架可驱动T细胞表型谱系塑造，尤其是对持续肿瘤杀伤至关重要的T干细胞记忆（TSCM）和中央记忆（TCM）表型。
2.4 用于形貌和曲率介导T细胞刺激的纳米结构材料
由PDMS微柱产生的微米级形貌可改变细胞骨架动力学、免疫突触形成及激活结果，与同等模量平面相比增强激活和增殖。PDMS微坑可诱导富含肌动蛋白的突起形成，对T细胞激活具有双相效应。将这一方法扩展至纳米尺度更具挑战性，因PDMS前体高黏度难以复制亚微米特征。采用自下而上方法合成的纳米线（如氧化锌、硅纳米线阵列）可通过高密度纳米形貌增强淋巴细胞激活。纳米线的长度决定其柔韧性及阵列对细胞力的集体力学响应，表明形貌与弹性的耦合效应。值得注意的是，未功能化的纳米线本身即可诱导高于未功能化平面的T细胞激活，且随纳米线长度增加（力学阻力降低）而增强，推测与细胞-纳米线界面高膜曲率诱导TCR与CD45磷酸酶分离有关。类似效应亦见于具有尖刺表面形貌的抗CD3/CD28包被金纳米颗粒，以及未功能化的阳极氧化铝纳米孔阵列（约200 nm孔径最有效）。
2.5 用于控制配体分布和受体簇集的纳米图案化材料
早期研究使用光刻技术制作微米级抗CD3功能化微域，周围为ICAM（整合素配体），部分模拟成熟免疫突触结构。然而，常规光刻分辨率有限。后续纳米制造进展使配体组织达到纳米尺度。通过嵌段共聚物光刻或纳米压印光刻制作的金属纳米点阵列可呈现连续配体阵列，用于建立最佳配体间距。电子束光刻可制作任意排列的纳米点，揭示局部簇集比总体配体密度更能决定T细胞响应。理论模型基于合作性受体-配体结合：初始受体-配体键抑制局部膜波动，增加邻近受体结合概率，形成正反馈直至局部簇饱和。
2.6 具有可调物理线索的多功能材料用于CAR T细胞生成
Mooney团队合成了脂质双层包被的介孔二氧化硅纳米棒，表面锚定抗CD3/CD28，内部装载可释放旁分泌因子。该材料在细胞培养中形成3D支架，T细胞可浸润其中。相比Dynabeads显著增强小鼠和人T细胞多克隆扩增，尤其能有效再刺激CAR T细胞。后续工作表明该纳米棒可通过控制刺激剂量实现患者特异性CAR T细胞免疫治疗结果，提示刺激步骤可个体化定制而非标准化。本团队将由抗CD3/CD28功能化PDMS纳米柱组成的激活表面用于CAR T细胞生产。通过独立变化形貌和模量，创建了刺激表面文库，利用多变量分析确定了能同时提供高激活、高增殖、低耗竭和高转导效率的表面设计。与Dynabeads相比，该平台增加了CAR T细胞中央记忆表型比例，并在体外和体内肿瘤杀伤实验中改善抗肿瘤效力。最佳性能的纳米柱为亚微米尺寸，后续通过基于自组装的新颖图案化方法实现了可规模化生产。
2.7 用于有效CAR T细胞生成的黏弹性材料
天然T细胞环境（包括APC和靶细胞）是黏弹性的，材料应力松弛行为可独立于弹性刚度调控T细胞命运。Liu等人使用微流控平台制备了藻酸盐基黏弹性颗粒，通过低分子量藻酸盐离子交联实现快速应力松弛，高分子量藻酸盐共价交联模拟纯弹性颗粒。研究发现应力松弛（即黏弹性）而非静态弹性是T细胞命运的主要调控者。黏弹性SynVACs增强免疫突触形成、增加T细胞扩增、驱动CD8+偏倚、显著富集干细胞样记忆T细胞（TSCM）并减少调节性T细胞形成。这些表型优势转化为约90%的CAR转导效率、增强的细胞毒性以及优越的体内持久性和肿瘤控制。
3 用CAR进行T细胞基因重编程
3.1 CAR重编程——当前技术现状和局限
标准CAR T细胞制造中，转导步骤涉及将携带CAR转基因的复制缺陷型病毒载体（最常见为慢病毒或γ-逆转录病毒载体）暴露于激活T细胞，实现稳定基因组整合和持续CAR表达。病毒递送的优势包括高转导效率、稳健表达和与增殖/非分裂细胞兼容，主要局限包括高生产成本、工艺复杂性、载荷限制及插入诱变风险。非病毒方法可简化制造避免病毒载体生产，但mRNA递送需重复给药，DNA/转座子/基因编辑方法在递送效率、基因毒性和临床标准化方面仍面临挑战。临床制造中CAR T细胞病毒转导效率常报告为约30%–70%，且供体间差异显著。
3.2 用于改善病毒转导的纳米技术
Aramesh等人报道使用聚己内酯纳米多孔基底改善T细胞慢病毒摄取，转导效率呈尺寸依赖性提高，约500 nm孔效果最佳，所得CAR T细胞在体外杀伤实验中表现出更高细胞毒性，机制可能为纳米孔形貌增强巨胞饮作用。另一种方法基于糖代谢生物正交化学引导的病毒转导：用Ac4GalNAz处理T细胞使其表面引入叠氮基团，DBCO功能化慢病毒通过叠氮-炔环加成特异性结合叠氮标记T细胞。该方法生产的CD19 CAR T细胞在B细胞淋巴瘤异种移植小鼠模型中表现出改善的抗肿瘤效力，包括增强的细胞增殖、浸润和细胞因子分泌。
3.3 用CAR进行非病毒编程
mRNA电穿孔可在1–2天内完成制造，避免插入诱变和复杂病毒生产，便于重复给药和快速CAR原型设计。但表达短暂（通常6–24小时达峰，3–7天内减弱），需重复输注且持久性有限。目前无FDA批准的基于mRNA转染的CAR T疗法，但多种mRNA CAR T细胞正在早期临床试验中评估。标准比色皿电穿孔面临转染效率与活力之间的权衡（常为40–70%活力、60–80% CAR+细胞）、电场不均匀导致mRNA摄取异质及可扩展性限制。
Mitchell团队探索了使用脂质纳米颗粒（LNPs）向人T细胞递送mRNA。他们合成离子化脂质纳米颗粒文库，筛选出最佳制剂用于原代人T细胞CAR mRNA递送，所得CAR表达与电穿孔相当，但细胞毒性显著降低。后续研究优化脂质配方提高递送效率；进一步将CAR mRNA与靶向PD-1的小干扰RNA（siRNA）共封装，实现瞬时CAR表达和短暂PD-1阻断。另一修饰将激活和共刺激抗体功能化于mRNA封装LNP表面，将激活与CAR递送结合，可跳过磁珠激活步骤，简化缩短生产周期。Voelker团队开发了基于硅纳米管阵列的被动递送平台，PCR表达盒装载抗CD19 CAR，细胞通过紧密膜内陷产生局部应力和膜透化实现递送。Shokouhi等人将该平台与电刺激结合，施加10 V脉冲局部电场，在细胞膜与纳米管界面形成瞬时孔，实现>90%活力和约70%转染效率，约为被动递送系统效率的两倍。
4 CAR T细胞的体外扩增
体外扩增是常规CAR T细胞生产的最后制造阶段，通常持续约1–2周（多为9–14天），目标是将工程化T细胞群扩增至临床剂量（数亿至数十亿细胞）。主要挑战包括在大规模扩增同时保持细胞适应性，因长时间培养可导致分化、干细胞样特征丧失和持久性下降。当前临床扩增多使用GMP条件下封闭或半封闭生物反应器或透气袋系统进行悬浮培养。为更好模拟淋巴微环境，研究者开发了多种工程化人工扩增环境。Castellote-Borrell等人基于聚乙二醇-肝素混合物构建含互连微孔的水凝胶，优化孔径和刚度后，CAR T细胞复制指数较悬浮培养提高约2倍。Jie等人使用自组装肽凝胶，在优化基质刚度条件下，CAR T细胞扩增较传统方案增加约10倍且缩短增殖时间；工程化CAR T细胞分泌内在PD-1 scFv进一步提高了体内抗肿瘤活性。Adu-Berchie等人报道了胶原基CAR T细胞微环境，可独立控制弹性和应力松弛。慢松弛基质促进更激活的效应样状态（高AP-1信号、抑制性标志物升高、记忆标志物降低），快松弛基质则保持记忆样表型。在CAR T细胞实验中，慢松弛基质培养的细胞在某些刺激条件下表现出更强的体外细胞毒性和体内肿瘤控制，但慢性刺激可能加剧功能障碍。Lv等人使用基于纤维蛋白的凝胶微环境，通过软3D纤维蛋白环境与β2整合素结合，招募14-3-3ζ磷酸化并隔离YAP，解除MafG转录因子抑制，激活干性相关基因，将分化T细胞转化为干细胞样表型。CAR T细胞在纤维蛋白凝胶中自发形成球体，在实体瘤模型中较常规2D扩增对照表现出优异的体外细胞毒性和体内肿瘤控制。
5 用于体内CAR T细胞制造的纳米技术
体内CAR T细胞生成旨在绕过复杂、昂贵、耗时的体外制造流程。直接向患者体内T细胞递送基因工程组件（病毒载体或纳米颗粒系统），实现原位生成功能性CAR T细胞。然而，该范式面临选择性高效靶向T细胞、控制转导水平、避免脱靶基因递送及减轻免疫反应等挑战。纳米材料可作为可编程载体整合三种关键功能：(i) 靶向、(ii) 激活和 (iii) 基因递送。靶向通常通过表面功能化配体（如抗CD3或抗CD8抗体）实现；基因载荷（mRNA、DNA或病毒载体）通过封装或缀合保护并控制胞内释放。早期示例包括基于可降解聚(β-氨基酯)（PBAE）聚合物、表面缀合PGA-抗CD3? F(ab')2、装载piggyBac转座子质粒的约150 nm颗粒，在免疫活性小鼠B细胞急性淋巴细胞白血病模型中，五次静脉给药可重编程宿主T细胞，根除肿瘤且毒性极小。另一PBAE基mRNA递送纳米颗粒表面偶联抗CD3和抗CD28抗体，约200 nm，近中性表面电荷，全身给药诱导强效瞬时CAR T细胞生成，单次给药后血液中B细胞耗竭达约95%。Mitchell团队将C14–4脂质基mRNA递送LNPs经马来酰亚胺-PEG脂质偶联抗CD3、抗CD5、抗CD7抗体，实现体内T细胞选择性转染，CD3和CD7靶向颗粒效果最佳，生成瞬时CD19 CAR表达导致血液和脾脏显著B细胞耗竭。早期临床研究（如ESO-T01）已证明患者体内生成功能性CAR T细胞的可行性，但也报告了包括细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征在内的显著毒性。淋巴结靶向递送因其高T细胞密度和稳态细胞因子（IL-7、IL-15、IL-2）支持环境而具有吸引力。纳米材料特异性安全需独立考虑，包括对载体成分的免疫应答、补体激活、不可降解材料蓄积、降解产物毒性及批次依赖的生物分布变化。
6 用于CAR T细胞制造分析和纳米技术的质量控制
当前CAR T细胞质量控制（QC）策略劳动密集、耗时且高度依赖中心化实验室设施。标准放行检测包括无菌检测、活力测量、免疫表型分析、载体拷贝数分析、效力检测及复制competent病毒检测。纳米技术赋能传感平台提供解决方案：纳米级生物传感器具有高表面积体积比和可调表面化学，可对小体积样品中的细胞、分子和代谢生物标志物进行高灵敏度和实时检测。电化学纳米传感器、等离子体纳米颗粒、纳米线检测器和阻抗传感系统均可快速检测低丰度生物分子。微流控系统集成纳米传感元件可进行单细胞分析、细胞外囊泡分析和动态分泌因子监测。阻抗传感系统已可实现CAR T细胞制造过程中无标记实时功能监测。这些技术可促进闭环制造系统，即分析反馈动态指导培养条件和过程优化。此外，纳米技术QC系统在分散式和即时护理制造模式中发挥重要作用。人工智能（AI）和机器学习方法已用于优化mRNA疫苗的抗原选择和脂质纳米颗粒配方，这些原则与体内CAR T工程的相关靶向mRNA递送策略密切相关。
6.1 监管和制造考量
纳米技术赋能的CAR T细胞制造临床转化需要将纳米材料特有的化学、制造和控制与既定细胞/基因治疗GMP要求整合。质量源于设计（Quality-by-Design）框架尤其相关，因为关键材料属性和工艺参数（如粒径分布、组成、载荷封装、配体密度、稳定性和残留杂质）可直接影响效力、生物分布和安全性。监管评估将扩展至最终CAR T细胞表型之外，包括纳米材料或递送组分的可重复表征和制造。
7 总结、未来方向和新兴视角
本综述总结了纳米技术和纳米材料如何被整合到CAR T细胞制造的主要阶段，包括T细胞激活、基因工程、扩增、体内生成和制造分析。纳米尺度材料属性可作为主动制造参数，塑造CAR T细胞生产的效率和所得细胞的治疗特性。纳米技术还提供了CAR基因递送和细胞扩增的多种策略。随着CAR T细胞制造向更短、去中心化和潜在自动化生产流程发展，对快速、集成、实时分析平台的需求日益增加。纳米技术赋能传感平台可实现闭环制造。该领域正经历从静态、劳动密集生产流程向动态工程化和生物学信息化的制造系统转变。纳米技术有助于在激活强度、转导效率、增殖能力、持久性、耗竭抵抗和安全性之间取得平衡。未来发展方向包括将传感技术、自动化和计算分析整合到CAR T细胞制造管线中，以及体外和体内制造方法边界的融合。经济价值将取决于处理时间、劳动力、设施要求和产品变异性的减少能否抵消特种材料、制造和分析控制的额外成本。纳米技术的进步正在将CAR T细胞制造从经验性生产过程重新定义为可编程的工程学科，有望提高CAR T细胞疗法的可扩展性、可及性以及生物学质量和治疗持续时间。
