《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Vibrational spectroscopy and artificial intelligence for dynamic phenotypic characterization of antimicrobial resistance
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抗菌药物耐药性（AMR）的快速出现已产生对能够快速识别耐药表型并指导精准抗菌治疗的诊断技术的迫切需求。传统抗菌药物敏感性试验（AST）方法在临床上仍然可靠；然而，其受到相对较长周转时间和有限生理分辨率的限制。近年来，振动光谱技术已成为快速表型微生物学有前景的平
抗菌药物耐药性（AMR）的快速出现已产生对能够快速识别耐药表型并指导精准抗菌治疗的诊断技术的迫切需求。传统抗菌药物敏感性试验（AST）方法在临床上仍然可靠；然而，其受到相对较长周转时间和有限生理分辨率的限制。近年来，振动光谱技术已成为快速表型微生物学有前景的平台，因为这些技术可产生与蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物和膜生物分子相关的无标记生化指纹。当与机器学习（ML）和人工智能（AI）整合时，这些技术可能为快速细菌分类、耐药性预测以及抗生素暴露期间动态生理适应监测提供高灵敏度工具。该综述讨论化学计量学、ML和深度学习（DL）算法与光谱数据集的整合，强调预测性能和生物学可解释性。该策略对多种微生物物种的细菌鉴定、生化表征和耐药谱分析非常有用。文中还审视了关于基因型与表型诊断、可重复性、标准化和AI可解释性的主要争议。最后，研究人员强调当前研究空白和未来方向，包括单细胞光谱、多模态表型分析、可解释人工智能（XAI）框架和系统微生物学方法。综上，现有证据表明，将振动光谱与AI整合可能显著重塑未来AMR诊断和机制微生物学。
1 引言（Introduction）
抗菌药物耐药性（AMR）对现代医学和全球公共卫生构成重大挑战，可降低现有抗生素有效性并增加发病率、死亡率、住院时间和医疗成本。该综述从快速诊断技术以及新型抗菌化合物与AI药物开发两个互补视角切入，并强调细菌耐药不能仅由孤立遗传决定因子解释，而涉及膜重塑、应激反应激活、代谢可塑性和调控网络重构等动态适应过程。文中以动态抗菌应答表型作为整合分析框架，用于监测抗菌暴露后的时间依赖性细菌反应，并明确该框架不表示耐药、耐受、持留、异质性耐药、生物膜相关存活和可逆应激反应之间的生物学或操作等价。传统微生物学方法仍属必要，但周转时间较长，可能延迟靶向治疗并促进经验性抗生素过度使用；ESKAPE病原体等耐药问题进一步凸显快速识别耐药株的重要性。傅里叶变换红外（FTIR）和拉曼（Raman）光谱可获取无标记生化指纹，结合人工智能（AI）、化学计量学和机器学习（ML）可处理高维光谱数据并识别与耐药表型相关的非线性生化模式，且有望监测适应性动态、过渡性生理状态和耐药演化。
2 背景（Background）
2.1 抗菌药物应答表型的操作性定义（Operational definitions of antimicrobial-response phenotypes）
该节区分耐药（resistance）、耐受（tolerance）、持留（persistence）、异质性耐药（heteroresistance）、适应性耐药（adaptive resistance）、生物膜相关耐受（biofilm-associated tolerance）和抗菌应激反应（antimicrobial stress response），并指出这些现象不应被视为可互换结果。其表征需要不同实验终点，包括最低抑菌浓度（MIC）测定与临床折点分类、时间-杀菌曲线、最低杀菌持续时间（MDK）、菌落形成单位（CFU）计数、群体分析谱、最低生物膜抑制浓度（MBIC）、最低生物膜根除浓度（MBEC）及生理或光谱应激生物标志物等。文中还概述了聚合酶链反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、DNA测序、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、流式细胞术及微纳液滴等快速抗菌药物敏感性试验（AST）相关技术，并提及抗菌肽、噬菌体治疗、CRISPR系统及纳米技术药物递送等替代或互补策略。AMR应被视为涉及基因组、表型、临床和环境决定因素的多因素动态现象。
2.2 振动光谱平台的比较能力（Comparative capabilities of vibrational-spectroscopy platforms）
该节强调振动光谱平台提供互补而非可互换的微生物组成与抗菌应答信息。衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）可快速获得生化指纹且样品制备较少，但光谱质量受生物量、水合、基底性质和样品与晶体接触影响；透射FTIR要求薄而均匀样品；FTIR显微光谱可提供微生物聚集体或微菌落空间信息，但受中红外空间分辨率限制。常规Raman受水影响较小并可分析单细胞，但信号弱、荧光、光损伤和采集时间较长仍是限制；表面增强拉曼散射（SERS）提高灵敏度，却强依赖基底重现性和纳米颗粒组织；共振Raman对特定发色团具有较高分子选择性，但不能捕获完整细胞生化指纹。单细胞Raman及拉曼-氘同位素探针（Raman-DIP）可检测抗菌诱导的代谢变化并研究异质性和稀有亚群，但需与MIC、时间-杀菌试验和公认易感性分类验证；原子力显微镜-红外（AFM-IR）可提供纳米尺度化学信息，但通量低且仪器复杂，目前主要用于机制研究。时间分辨FTIR结果不能自动推广至Raman、SERS、共振Raman、单细胞Raman或AFM-IR，平台特异的分析和生物学验证是光谱特征用于抗菌易感性解释或直接临床标本应用的前提。
2.3 抗生素靶点及相关光谱改变（Antibiotic targets and associated spectroscopic alterations）
该节归纳主要抗生素类别、其细菌靶点及可用振动光谱检测的AMR相关生化适应。β-内酰胺类和糖肽类主要引起细胞壁结构和肽聚糖组织改变；多粘菌素和脂肽类强烈影响膜完整性和磷脂组成；氟喹诺酮类和利福霉素类等核酸合成靶向药物常诱导DNA损伤、转录应激和调控适应相关光谱特征；氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类等蛋白质合成抑制剂与核糖体蛋白、应激反应通路和代谢补偿机制改变相关；磺胺类和甲氧苄啶影响叶酸代谢并引起广泛代谢指纹变化。生物膜相关AMR涉及胞外多糖、基质蛋白和休眠生理，多重耐药（MDR）则表现为跨蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸的整合光谱协方差变化。文中强调AMR不应仅解释为遗传现象，而应视为涉及多细胞结构和代谢通路协调生化重塑的系统适应性过程；动态光谱协方差结构可反映膜重塑、外排激活、代谢可塑性、生物膜持留和调控网络重组，时间光谱分析可揭示耐药演化轨迹和过渡性生理状态。
3 讨论（Discussion）
3.1 从光谱模式到生物学洞见（From spectral patterns to biological insight）
该节指出用于振动光谱的计算方法互补而非可互换，其适用性取决于生物学问题、数据集大小与结构、预期非线性和所需解释层级。主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）适用于探索性分析、光谱变异可视化和聚类或时间轨迹检测，但作为无监督方法，其表观分组不应在缺乏独立监督验证时解释为预测性分类。线性判别分析（LDA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）可提供相对透明的模型，适用于独立生物样本数有限且类别分离近似线性的情形，但其载荷和回归系数不能确立机制生物标志物，且在高变量-样本比或预处理不当情况下存在过拟合风险。支持向量机（SVM）和随机森林（RF）可处理非线性分类，但SVM依赖核函数、正则化和超参数调优，RF的变量重要性可因高度相关光谱带而分散，增加生化解释难度。人工神经网络（ANN）和卷积神经网络（CNN）可学习复杂光谱模式并识别局部峰形及相邻波数关系，但通常需要更大、更多样数据集、更高计算资源和严格外部验证，小样本或同质数据易学习菌株、实验室或仪器特异信号。时间响应分析需区分横断面分类与纵向建模，并应以独立生物培养、菌株或分离株的重复测量为基础；同一生物样本的多个光谱属技术重复，不应独立划分训练集和测试集，以免信息泄漏和性能虚高。可解释人工智能（XAI）如SHapley Additive exPlanations（SHAP）、局部可解释模型无关解释（LIME）、置换重要性和类激活映射可支持光谱变量归因，但其输出描述模型统计行为而非证明生物学因果，需通过光谱带指认、参考微生物学、功能试验及互补分子或组学测量确认。尚无单一计算策略适用于所有光谱AMR应用；临床导向应用在性能相当时宜优先选择较简单且内在可解释的模型。
3.2 从光谱前景到临床实践所需的转化证据（Evidence required for translation from spectral promise to clinical practice）
该节强调，振动光谱可检测抗菌暴露和耐药表型相关生化变化，但在受控实验室条件下显示光谱差异并不等同于提供临床可操作的AST结果。临床转化首先需与公认参考AST方法如肉汤微量稀释或琼脂稀释比较，并将光谱预测与参考MIC值和现行临床折点关联。除分类准确性外，研究应报告必要一致性和分类一致性、重大错误和极重大错误、置信区间（CI）以及不确定或失败结果；仅区分既往标记易感和耐药分离株的模型应描述为易感性分类器，而非经验证的AST平台。验证应纳入代表不同物种、遗传背景、耐药机制、抗菌药物类别和MIC分布的独立临床分离株，尤其是接近临床折点的分离株；训练和验证数据应在分离株水平而非技术光谱水平分离，并需跨机构、操作者、地区和仪器的外部评价。该节提出从机制实验室研究、概念验证易感性分类、分析验证、临床验证到常规临床实施的转化阶段及最低证据要求。临床相关基质如血液、尿液、呼吸道分泌物和伤口样本可含宿主细胞、蛋白质、盐、残留抗菌药物等干扰，低菌量可能需要富集、浓缩、过滤、洗涤或短培养，混合标本因群体水平光谱可能合并不同易感性生物而尤为困难。分析验证还需标准化样品制备、仪器校准、光谱质量标准、对照和仪器漂移监测；FTIR需控制水合、样品厚度、光学接触和基底组成，Raman和SERS还需控制激光功率、荧光、光损伤及基底或热点变异，预处理流程和模型版本应锁定并设定预定接受标准和常规质量控制。临床效用还取决于实操时间、失败率、生物安全、成本、试剂需求、与实验室信息系统（LIS）和抗菌药物管理（AMS）流程的整合，周转时间应覆盖从标本接收到可解释结果的全过程。当前多数振动光谱研究仍应视为机制性或概念验证研究，尚需采用目标使用人群连续标本的前瞻性多中心研究确定常规条件下性能及是否缩短有效治疗时间而不增加假易感结果。
3.3 从分离株到群落（From isolates to communities）
该节指出多数FTIR和Raman的AI模型基于单培养建立，每个光谱可对应单一物种或菌株，但未必反映多微生物感染复杂性。混合样本光谱可合并不同丰度、生理状态和治疗反应生物的信号，群落组成变化可在各生物表型未变时改变光谱轮廓；FTIR虽可区分定义明确的1:1大肠杆菌（
Escherichia coli）和铜绿假单胞菌（
Pseudomonas aeruginosa）混合物与相应纯培养，但尚不能确立在物种比例不等或变化群落中的性能。微生物群落中抗菌易感性还可能依赖邻近生物相互作用，耐药菌可通过降解抗菌药物、改变局部环境或群落生理保护较敏感细胞；在囊性纤维化肺部感染模型中，多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌（
Stenotrophomonas maltophilia）通过β-内酰胺酶介导的亚胺培南灭活保护敏感铜绿假单胞菌（
P. aeruginosa），使MIC升高达16倍，该效应依赖嗜麦芽窄食单胞菌丰度且未在美罗培南中重现。混合菌株群体和异质性耐药亦带来困难，小耐药亚群可能隐藏于以敏感为主的群体中而对总体或群体平均光谱贡献过小；单细胞研究显示抗菌暴露期间细菌生长和耐药基因表达存在显著变异，Raman AST模型提示频率低至10
?6的耐药亚群可能被检测但需更长孵育，拉曼集成中红外光热显微可在单细胞水平可视化抗生素异质响应。用于多微生物样本的模型应以物种或菌株组成、耐药机制和相对丰度不同的预定义混合物验证，并在抗菌暴露前后检查，与选择性培养、群体分析谱、分子鉴定和分离株特异性MIC测定等物种分辨参考方法比较，报告可检测耐药生物或亚群的最低丰度，并判断模型能否区分内在耐药与邻近细胞提供的保护。可能的策略包括光谱解卷积、多标签分类、物种特异细胞分离和单细胞分析；受激拉曼散射（SRS）联合ML已在尿液中约3 h内实现混合大肠杆菌和金黄色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus）群体的物种分辨AST，荧光原位杂交（FISH）联合单细胞AST可解析混合样本中各物种易感性，但跨临床代表性多微生物感染的更广泛验证仍属必要。
4 结论与展望（Conclusion and outlook）
振动光谱结合化学计量学和AI为表征细菌对 antimicrobial 暴露的生化与生理响应提供了有前景的框架。FTIR、基于Raman的方法及新兴单细胞平台在不同分析尺度提供互补信息，计算方法可支持模式识别、易感性相关分类、时间分析和假设生成。然而，与抗菌暴露相关的光谱改变不应被解释为耐药的直接证据，也不能替代经临床验证的AST。未来进展取决于标准化样品制备和光谱采集、透明且可重复的计算流程、独立外部验证，以及与公认参考AST方法和临床折点的直接比较。纳入多样临床分离株、相关生物基质、多微生物样本和多中心前瞻性设计的研究对确立泛化性和临床效用尤为重要。单细胞光谱、多模态振动方法和XAI可进一步提高生物学分辨率，但计算归因须由互补实验验证支持。总体而言，这些发展可能推动振动光谱从以机制和概念验证为主的平台，发展为更稳健的抗菌应答表型分析工具，并最终成为临床相关微生物学研究工具。
