《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Comprehensive characterization of the cellular and molecular consequences of LCN2 loss in MDA-MB-231 triple-negative breast cancer cells
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引言： 三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性乳腺癌亚型，具有高转移潜能且靶向治疗选择有限。Lipocalin-2（LCN2）已被认为与肿瘤进展和转移播散有关，但其在TNBC中的功能作用仍未完全阐明。本研究探讨了LCN2在人TNBC细胞系MDA-M
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引言： 三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性乳腺癌亚型，具有高转移潜能且靶向治疗选择有限。Lipocalin-2（LCN2）已被认为与肿瘤进展和转移播散有关，但其在TNBC中的功能作用仍未完全阐明。本研究探讨了LCN2在人TNBC细胞系MDA-MB-231中的作用。
方法： 研究人员采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立了稳定的LCN2缺陷型（LCN2KO）细胞，并分离了单细胞来源的克隆。通过RNA测序（RNA-seq）表征转录组变化，并利用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证筛选出的发现。采用蛋白质印迹法（Western blotting）评估蛋白水平变化。通过Transwell迁移和侵袭实验以及黏附实验评估功能效应。
结果： LCN2KO细胞基本保留了亲本细胞的间充质表型。RNA测序揭示了与炎症信号传导、铁稳态、氧化应激、铁死亡相关过程以及细胞代谢相关的变化。功能实验表明，细胞迁移、侵袭和黏附能力降低，并伴随对细胞外基质组分的黏附改变。
讨论： LCN2缺陷与MDA-MB-231细胞的转录和功能变化相关，尤其影响迁移和侵袭行为以及细胞-基质相互作用，同时基本保留间充质表型。这些发现为LCN2在与TNBC进展和转移行为相关的细胞过程中的作用提供了进一步见解。
论文解读
一、研究背景与科学问题
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的主要原因之一。根据激素受体（雌激素受体、孕激素受体）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达情况，乳腺癌可分为四种分子亚型：Luminal A、Luminal B、HER2阳性型和三阴性型。三阴性乳腺癌（TNBC）以缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2表达为特征，治疗选择极为有限。尽管TNBC仅占所有乳腺癌病例的10%–17%，但该亚型表现出不成比例的侵袭性和临床挑战性，常伴随早期转移，导致预后不良。
Lipocalin-2（LCN2）是一种25-kDa的分泌蛋白，也称为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），属于脂质运载蛋白超家族，具有高度保守的八链反平行β-桶状结构。LCN2是一种功能多样的蛋白，在生理和病理过程中发挥多种作用。生理条件下，它作为疏水分子（包括脂肪酸、类固醇、激素和维甲酸）的转运蛋白；此外，它还通过结合细菌分泌的肠杆菌素来螯合铁，在先天免疫系统中发挥作用。在病理背景下，癌细胞可利用其铁结合能力，这与肿瘤进展、转移和复发相关。此外，人LCN2与基质金属蛋白酶-9（MMP-9）相互作用，通过LCN2与MMP-9前肽区之间的二硫键形成LCN2–MMP-9复合物，保护MMP-9免受自身降解，从而维持其细胞外蛋白水解活性。由于MMP-9参与细胞外基质降解和重塑，LCN2–MMP-9轴被认为与肿瘤细胞迁移和侵袭有关。
尽管LCN2在TNBC中的表达升高与晚期疾病和转移播散相关，但其促进TNBC进展和转移播散的精确分子机制仍未完全阐明。鉴于LCN2在不同肿瘤类型中具有背景依赖性和有时相反的功能，对TNBC中其下游信号网络进行特异性解析，对于阐明其机制贡献并评估其作为生物标志物或治疗靶点的潜力至关重要。为此，本研究利用稳定的CRISPR/Cas9介导的LCN2敲除模型，进行了单细胞分离、克隆扩增和表征，系统分析了细胞形态和表型、转录组谱以及包括迁移和黏附在内的功能特性。
二、主要关键技术方法
研究人员首先对所用细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468进行了短串联重复序列（STR）谱系分析以确认细胞身份。随后采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过共转染供体DNA质粒（LoxP-EF1A-tGFP-P2A-Puro-LoxP）和两个引导RNA（gRNA）载体，在MDA-MB-231细胞中建立稳定的LCN2基因敲除（LCN2KO），经单细胞分离获得多个克隆。通过蛋白质印迹法（Western blotting）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证敲除效果。利用多色荧光原位杂交（M-FISH）分析比较亲本细胞和敲除克隆的染色体组型。通过透射电子显微镜（TEM）进行亚细胞超微结构分析。采用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，使用DESeq2进行差异基因表达分析，并利用基因集富集分析（GSEA）和基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析进行通路解析。功能层面采用Transwell迁移和侵袭实验、细胞黏附实验（分别包被Geltrex、I型鼠尾胶原和明胶）以及基于ATP的发光增殖实验。此外还进行了瞬时转染LCN2表达载体以开展回补（rescue）实验。
三、研究结果
3.1 LCN2敲除MDA-MB-231细胞的建立与验证
STR分析确认了亲本细胞系的真实性。Western blot分析显示，LCN2KO1和LCN2KO3群体在基础状态和IL-1β诱导条件下均无LCN2表达，表明功能性敲除成功；LCN2KO2表现出可诱导的LCN2表达，提示为杂合敲除。单细胞克隆#7、#12和#15经RT-qPCR和Western blot确认完全丧失LCN2表达，且经IL-1β、TNF-α、TGF-β1和IL-6等促炎细胞因子刺激后仍无LCN2诱导表达。M-FISH分析表明，LCN2KO #15保留了亲本细胞系的主要染色体结构重排特征，无基因组编辑引起的大规模染色体异常，差异符合亚克隆选择而非编辑相关基因组不稳定性。
3.2 LCN2敲除细胞的形态和表型特征
光学和荧光显微镜显示，LCN2KO #15细胞基本保留亲本细胞的纺锤形、长梭形间充质形态，但出现形成增大细胞的倾向。增大的LCN2KO #15细胞呈现F-肌动蛋白应力纤维，并伴有多个细胞核或增大细胞核。透射电子显微镜显示两种细胞系均具有突出的细胞核、丰富的常染色质和明显的核仁，线粒体呈椭圆形至长形并具有管状嵴；LCN2KO #15细胞中溶酶体数量略多于亲本细胞。Western blot和RT-qPCR分析显示，间充质标志物纤连蛋白1（FN1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白在亲本和敲除克隆中持续表达，而上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）在敲除克隆中检测不到，CDH1 mRNA表达下调，表明敲除细胞维持了间充质身份。
3.3 亲本MDA-MB-231与LCN2KO #15的转录组分析
主成分分析（PCA）显示LCN2KO与亲本样本沿PC1明显分离，PC1和PC2共解释88.21%的转录变异。GSEA和GO分析显示，LCN2KO #15中上调基因富集于先天免疫和炎症通路，包括趋化因子应答、细胞因子介导的信号传导、核糖体生物发生、rRNA加工、翻译通路和经典NF-κB信号传导；下调基因主要与线粒体组织、代谢通路、细胞外基质组织和蛋白运输相关。
3.3.1 间充质表型相关转录特征
转录组分析显示，关键间充质相关基因VIM和CDH2在LCN2KO #15中基本不变，FN1和ITGA5上调；上皮相关基因CDH1、KRT8和KRT18表达降低，但EPCAM、CLDN1和OCLN不变或升高，未显示协调的上皮-间充质转化（MET）特征。细胞可塑性和混合EMT状态相关基因显示混合变化：AXL表达降低，CD44表达升高，TGFBR1和TGFBR2不变。总体表明LCN2缺陷未导致MDA-MB-231细胞间充质/混合表型的显著改变。
3.3.2 铁稳态、氧化应激和铁死亡相关通路改变
铁代谢相关基因分析显示，LCN2KO细胞中TFRC、FTH1和FTL表达升高，SLC40A1不变。铁死亡相关基因中SLC7A11上调，GPX4和ACSL4表达降低，NCOA4无显著变化。氧化应激相关基因中，NFE2L2/NRF2不变，但其靶基因NQO1和GCLM表达升高，KEAP1升高，HMOX1不变；线粒体SOD2升高而SOD1降低。这些结果表明LCN2缺陷与铁代谢、铁死亡调控和氧化应激反应相关基因的表达改变有关。
3.3.3 炎症和转录调控通路富集
炎症和NF-κB相关基因分析显示，LCN2KO #15中RELA、NFKBIA和NFKBIZ表达升高，促炎细胞因子相关基因IL1B、IL6和CXCL8表达升高，其中CXCL8上调最为显著。RT-qPCR验证了NFKBIA、CASP1、CXCL1和IL1B表达升高。蛋白水平上，IκBα和IκBζ基础表达升高；IL-1β或TNF-α刺激后两种细胞系均观察到IκBζ诱导，但LCN2KO #15中NF-κB p65磷酸化在多种刺激条件下诱导减弱，总NF-κB水平不变。CXCL8蛋白在炎症刺激后两种细胞系中均被诱导，但RNA-seq显示的显著转录上调未在蛋白水平反映。
3.4 LCN2敲除对细胞迁移、侵袭和黏附的影响
Transwell迁移实验显示，LCN2KO #7和#15的迁移能力较亲本MDA-MB-231显著降低；LCN2回补表达后迁移能力较GFP转染对照增加。Transwell侵袭实验同样显示LCN2KO #7和#15侵袭能力降低，LCN2回补部分恢复侵袭能力。黏附实验显示LCN2KO #7和#15对未包被培养表面的黏附降低，LCN2回补显示黏附增加的趋势。在包被Geltrex、I型胶原或明胶的表面上，亲本和LCN2KO #15细胞对I型胶原的黏附均增加，LCN2KO #15达到与亲本相当的水平；Geltrex包被也增强了LCN2KO #15的黏附。ITGA2和ITGA6的转录和蛋白水平在LCN2KO细胞中均升高。增殖实验显示LCN2缺陷不影响细胞增殖。
四、讨论与结论总结
本研究表明，LCN2缺失导致细胞结构改变、细胞组织受损和信号传导改变。细胞外基质组装、重塑和细胞-基质黏附的同时抑制表明结构完整性下降和与周围微环境相互作用减弱。功能分析进一步支持这些发现，LCN2敲除后细胞黏附和迁移均降低。
关于LCN2敲除后出现的增大细胞形态，研究人员指出这可能与衰老样特征或衰老相关分泌表型（SASP）相符，但未评估经典衰老标志物，因此需谨慎解读。这种形态也常见于有丝分裂进程、胞质分裂或细胞周期调控缺陷，提示LCN2可能在维持细胞分裂保真度中发挥此前未认识的作用。转录组分析中下调基因富集于ECM组织、细胞外结构组织、蛋白定位至质膜和细胞大小调控等通路，这些通路与细胞-基质相互作用和细胞骨架组织密切相关，其破坏可能损害细胞分裂所需的机械和结构协调，最终导致多核化和细胞增大。
M-FISH分析确认敲除细胞系保留了亲本MDA-MB-231复杂的非整倍体核型结构，无新获得的大规模染色体畸变，表明基因组编辑策略未加剧基因组不稳定性，观察到的表型差异可能归因于靶向基因破坏而非潜在核型变化。
与既往研究不同，本研究中LCN2稳定敲除未导致向上皮形态的转变，反而出现CDH1/E-cadherin表达降低而波形蛋白不变。研究人员认为这可能反映了瞬时基因沉默与永久性基因消融的不同生物学后果，稳定敲除模型可经历长期细胞适应和补偿性变化，提示LCN2在上皮和间充质标志物调控中的作用具有背景依赖性。
NGS分析显示核糖体生物发生和翻译通路富集，但LCN2KO未增强增殖能力，表明这些转录变化不一定反映细胞周期进程加速。LCN2KO中IκBα和IκBζ蛋白基础表达升高，但NF-κB p65磷酸化在24小时刺激后减弱，由于p65磷酸化通常发生在刺激后数分钟内，现有数据不允许对经典NF-κB信号传导的早期激活动力学做出明确结论。CXCL8转录与蛋白表达的差异进一步提示转录后和翻译调控机制参与表型形成。
铁稳态方面，LCN2KO细胞中TFRC、FTH1和FTL表达升高，SLC7A11上调而GPX4和ACSL4降低，这些转录变化提示LCN2缺陷与铁处理和铁死亡相关过程的改变有关，但需要进一步功能研究确定这些变化是否对应铁代谢或氧化还原稳态的实际改变。
总体而言，LCN2缺陷与MDA-MB-231细胞的转录和功能变化相关，尤其影响迁移和侵袭行为以及细胞-基质相互作用，同时基本保留间充质表型。这些发现为LCN2在与TNBC进展和转移行为相关的细胞过程中的作用提供了进一步见解，也为评估LCN2作为TNBC预后生物标志物和治疗靶点的潜力奠定了分子基础。
