真菌降解椰枣核替代黄色玉米对体外瘤胃发酵、营养物质降解、产甲烷菌群落及甲烷生成的影响

《Frontiers in Veterinary Science》：Efficacy of fungi-degraded date pits as a potential alternative dietary energy source in farm animal diets

　　

椰枣核（date pits，DPs）是丰富且经济的日粮能量来源，有望作为牛饲养中昂贵精料的替代物。本研究采用半自动气体产生（gas production，GP）系统，考察以不同水平经Aspergillus parasiticus处理的椰枣核替代黄色玉米粒对体外瘤胃发酵特性、营养物质降解、产甲烷菌群落（methanogenic community）和甲烷（CH₄）产生的影响。体外试验中，基础日粮（50%精料混合物和50%三叶草干草）在不添加椰枣核（对照）以及以25%、50%、75%和100%真菌降解椰枣核（fungi-degraded date pits，FDDPs）替代比例条件下孵育。随着FDDP添加水平增加，GP、真降解干物质（truly degraded dry matter，TDDM）和真降解有机物（truly degraded organic matter，TDOM）值呈线性和二次降低（p = 0.001）。然而，FDDP添加未影响CH₄、分配因子（partitioning factor，PF）、总原虫、氨（NH₃）或主要短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的摩尔比例。根据系统发育分析，鉴定出的大多数产甲烷菌序列归属于Methanobrevibacter谱系。自举值（bootstrap values）范围为39%至67%，证实了观察到的聚类模式，并表明这些序列的进化相关性；使用不同水平FDDP时甲烷产生无显著差异。根据本研究结果可以认为，发酵椰枣核是玉米粒的有前景替代物，在反刍动物饲喂中对瘤胃发酵特性和产甲烷菌群落无不良影响。

研究背景与问题：反刍动物饲养中能量补充料成本因需求增长而急剧上升，促使营养学家寻找更廉价的高能替代饲料原料。玉米和大麦因可得性和消化率高而被广泛使用，这推动了对本地农工业副产物作为替代饲料原料的兴趣，尤其是不与人争食、可缓解饲料短缺并减少环境影响的副产物；反刍动物能有效利用高纤维日粮。椰枣主要种植于中东和非洲炎热地区，埃及是世界最大椰枣生产国，2020年FAO数据表明其占全球产量近21%、约170万吨。椰枣核（DPs）占椰枣总重约13–15%，在椰枣加工中大量产生，仅埃及每年约18.9万吨；若未合理利用或处理，可能造成环境问题，因此需要增值利用。DPs富含碳水化合物，是重要能源，并含纤维素、半纤维素和木质素等结构纤维，适合反刍动物日粮。Alyileili et al.指出，降解DPs含中等水平粗纤维、粗脂肪和粗蛋白，总碳水化合物87.2%，中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）74.6%、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）45.7%，表明其纤维性。DPs可作为精料配方中的良好替代饲料原料而不损害反刍动物生产效率；Sami et al.报道，以粉碎DPs替代大麦至50%并补充商业酶混合物作为天然生长促进剂，Naimi生长羔羊胴体性状可接受、肉质理想；Rabee et al.表明，将橄榄饼和椰枣副产物纳入动物日粮会影响动物性能、瘤胃发酵、微生物多样性和瘤胃细菌群；Bakr et al.表明，用DPs和大豆粕混合物替代10–20%黄色玉米和小麦麸对Barki羔羊生长性能、消化率、血液代谢物或瘤胃特性无负面影响；Faishal et al.报道，枣核粉在奶牛精料混合物中可纳入至15%而不负面影响干物质（dry matter，DM）消化率或血液指标，同时显著改善DM消化率。尽管许多研究探索DPs在家畜饲喂中的应用，但关于其对瘤胃微生物群影响的信息仍有限。细菌是瘤胃优势微生物并主导瘤胃发酵，发酵纤维素、木聚糖、直链淀粉和蛋白质等日粮组分，产生SCFAs和微生物蛋白；日粮组成影响瘤胃细菌组成和pH，高纤维日粮刺激纤维分解菌，富淀粉和可溶性糖日粮促进淀粉分解菌。高通量测序提高了对瘤胃微生物群落的理解，但结果仍可能受DNA提取方法、PCR引物、测序平台和生信分析流程影响。文献建议将瘤胃微生物群、功能基因、代谢通路、瘤胃代谢物和动物性能联系起来。然而，关于FDDPs对瘤胃产甲烷群落影响的信息极有限。研究人员假设FDDP补充可作为经济、高质量饲料能量替代源，因此本研究目的是评估以Aspergillus parasiticus处理DPs（农业废弃物）所得FDDP对体外瘤胃发酵特性、营养物质降解和产甲烷菌群落的影响。研究人员开展体外试验，采用五种等能等氮总混合日粮（total mixed rations，TMRs），由50%精料混合物和50%三叶草干草组成，并以0、25%、50%、75%和100% FDDP替代黄色玉米；结果表明FDDP可部分或全部替代黄色玉米而不损害瘤胃发酵特性和产甲烷菌群落，作为农业废弃物替代玉米可能降低精料饲料成本并具有潜在经济效益，但需进一步体内研究验证和评估实际应用。

关键技术方法：研究人员在Alexandria University相关实验室开展体外产气试验，采用半自动GP系统（压力传感器和数据记录器）于39 °C孵育24 h，以3头屠宰Holstein奶牛的新鲜瘤胃内容物为接种物来源；基础日粮为50%精料混合物加50%三叶草干草，设0、25%、50%、75%、100% FDDP替代黄色玉米处理。测定GP、TDDM、TDOM、pH、NH₃-N、SCFAs、CH₄和总原虫。产甲烷菌群落采用瘤胃基因组DNA提取、nested PCR扩增16S rDNA、测序、BLAST和MEGA11邻接法系统发育分析；数据用SAS广义线性模型和Duncan多重比较，并进行线性和二次正交对比。

研究结果：
3.1 In vitro experiment（体外试验）：通过24 h体外产气试验测定不同FDDP替代水平下GP、TDDM、TDOM、CH₄、PF、pH、总原虫、NH₃-N和SCFAs。结果表明，随FDDP替代水平增加，GP、TDDM和TDOM呈线性和二次降低（p = 0.001）；CH₄、PF、总原虫、NH₃和主要SCFAs摩尔比例未受FDDP补充影响；pH随FDDP水平增加呈线性（p = 0.012）和二次（p = 0.032）升高；heptanoic摩尔比例呈线性增加（p < 0.05），并有二次增加趋势（p = 0.076）。

3.2 Structure of the methanogenic community（产甲烷菌群落结构）
3.2.1 PCR amplification of the rumen samples（瘤胃样品PCR扩增）：通过长PCR和nested PCR引物扩增瘤胃样品，分别获得约800 bp长PCR产物和约178 bp nested PCR产物，并经琼脂糖凝胶电泳确认。
3.2.2 DNA sequencing and sequence analysis（DNA测序与序列分析）：通过对约179 bp PCR产物纯化后测序，并将所得核苷酸序列在NCBI上进行DNABLAST，与GenBank数据库参考菌株比较，依据相似性百分比进行鉴定。
3.2.3 Phylogenetic analysis（系统发育分析）：通过基于16S rRNA基因部分序列的邻接法构建系统发育树，发现两个明显簇；最大簇含11个操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）并与Methanobrevibacter相关，形成两个亚簇，自举支持值为29%；第一亚簇含9个序列几乎相同的OTUs，自举支持值为39%–67%，对应FDDP 0%、25%、75%和100%；第二亚簇分为2个OTUs，自举支持值为58%，对应FDDP 50%；第二簇外群为Methanobrevibacter oralis isolate，与100% FDDP处理相关。这些发现表明检测到的产甲烷古菌序列的系统发育归属和变异，而非全面评估总体产甲烷群落结构；不同FDDP水平下甲烷产生无显著差异。

讨论部分总结：农业副产物可作为干旱地区可行饲料替代物，但必须评估其对动物性能和瘤胃生态系统的影响；FDDP副产物富含可溶性碳水化合物，是有价值的能源，但蛋白含量低。本试验中，以FDDP替代玉米粒降低体外瘤胃GP，与Boufennara et al.报道的最高累积产气见于Kentichi品种废弃椰枣、最低产气见于椰枣核一致。FDDP替代玉米粒使瘤胃pH呈线性和二次升高，与Martel et al.观察到较高日粮糖浓度提高奶牛瘤胃pH一致；这可能与糖较淀粉提供较少可发酵碳用于产酸、瘤胃微生物可将糖直接发酵为微生物糖原、以及椰枣核日粮较高ADF和NDF维持更中性瘤胃pH有关。FDDP替代增加使体外TDDM和TDOM降低，与Alhomidy et al.评估废弃椰枣替代0%、15%和30%精料于Najdi羔羊日粮的结果相似；这可能与椰枣核高木质素和纤维含量限制微生物降解和发酵效率、从而降低产气有关，高NDF、ADF和木质素使高度木质化物质不易被瘤胃微生物利用，椰枣副产物中的酚类化合物和缩合单宁也可降低瘤胃降解效率。FDDP替代玉米粒对多数SCFAs浓度影响小，但heptanoic酸随FDDP纳入水平增加而增加，与先前研究相似，提示可溶性碳水化合物丰富日粮中瘤胃发酵途径改变，可能与适应快速可发酵糖源产生的氢流增加或乳酸向丁酸转化增强有关。基于产甲烷菌序列相似性，大多数序列与Methanobrevibacter spp.相关；尽管不同序列间相似性百分比仅为39%–67%，使用不同FDDP水平时甲烷产生无显著差异，FDDP替代比例未影响产甲烷菌多样性，与先前研究一致；Rabee et al.也未观察到瘤胃产甲烷菌丰度与甲烷排放之间存在明确关系。

5 Conclusion（研究结论）翻译：在实验条件下，结果表明FDDP是有前景的替代能源，可部分或全部替代黄色玉米粒，而不对反刍动物饲喂中的瘤胃发酵特性和产甲烷菌群落产生不良影响。此外，以FDDP这种农业废弃物替代玉米可能有助于降低精料饲料成本，从而提供潜在经济效益。仍需进一步体内研究验证这些发现，并更好评估FDDP在反刍动物营养中的实际应用。