《Journal of Dairy Science》：Comprehensive evaluation of metabolite imputation methods and the effect of imputation accuracy on the performance of metabolite-trait association using large-scale metabolite datasets in cattle
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代谢组学（metabolomics）数据通常跨多个批次采集，历时数月甚至数年，因此整合后的代谢物数据集常面临复杂的缺失值挑战，这些挑战源于仪器性能波动、检测窗口变化以及分析平台间的异质性。准确插补缺失值因此是应对这些挑战并提升下游代谢组学分析性能的关键策略。本
代谢组学（metabolomics）数据通常跨多个批次采集，历时数月甚至数年，因此整合后的代谢物数据集常面临复杂的缺失值挑战，这些挑战源于仪器性能波动、检测窗口变化以及分析平台间的异质性。准确插补缺失值因此是应对这些挑战并提升下游代谢组学分析性能的关键策略。本研究利用荷斯坦牛（Holstein cattle）的大规模真实血浆和血清代谢物数据集（n = ～3,000种代谢物；n = ～3,000个个体），每个数据集由2个批次组成，评估5种插补方法（MIRTH、PIXANT、EM、KNN和RF）对批次内缺失代谢物及批次间非重叠代谢物的插补性能。研究表明，RF在多数情况下获得最佳插补性能，批次内插补准确率约为0.6 ～0.7，跨批次插补准确率约为0.3 ～0.4。随后，研究人员利用经RF插补的代谢物数据，评估插补准确性对5个产奶性状的代谢物-性状关联分析（metabolite-trait association analysis）性能的影响。与使用原始代谢物数据识别出的显著关联代谢物相比，使用插补代谢物数据进行分析导致统计功效（statistical power）大幅降低，并增加假阳性关联（false-positive associations），尤其是当合并来自不同批次的插补数据时。未来需要通过开发新的插补方法并增加批次间重叠代谢物数量，进一步提高跨批次插补（cross-batch imputation）的准确性。解释性摘要：通过插补整合不同批次产生的代谢物数据集仍然具有挑战性，原因在于缺失数据的批次特异性。本研究利用来自约3,000头荷斯坦牛不同批次的真实代谢物数据，系统评估了5种代谢物插补方法，旨在比较其在批次内和跨批次缺失代谢物插补中的性能，并评估插补准确性对下游代谢物-性状关联分析的影响。研究人员的发现表明，对于跨批次插补，所评估方法的准确性有限，导致下游代谢物-性状关联分析性能较差。因此，该研究为大规模代谢物插补和下游代谢组学分析提供了一些有用的实践启示。
论文主体解读：代谢组学（metabolomics，系统检测生物体系代谢物组成的学科）数据常因实验方案、仪器信号、检测窗口和分析平台差异而分批生成，跨批次整合时存在大量非重叠代谢物，缺失值插补（missing-value imputation，利用观测数据推断缺失值）成为构建大规模统一代谢组数据集的重要策略。现有RALPS、MetabCombiner、apLCMS和PAIRUP-MS等方法通常依赖共享样本或特定实验设计；在批次间无共享个体时，跨批次插补只能依赖共享代谢物的相关结构，而动物年龄、生理状态、环境条件和样本质量均会影响代谢物浓度及插补准确性。已有MIRTH、PIXANT及Imputomics中的EM、KNN、RF等方法，但对其在真实跨批次条件下的系统评价仍有限。因此，研究人员利用荷斯坦牛大规模血浆和血清代谢组数据，比较5种方法在批次内和跨批次插补中的表现，并评估插补准确性对下游代谢物-性状关联分析（metabolite-trait association analysis，检验代谢物与性状统计关联的分析）的影响，为大规模代谢物插补及下游代谢组学分析提供实践依据。
技术方法概况：研究样本来自中国山东省9个农场的2,751头荷斯坦奶牛，全血分4批次采集；批次1（n=813）和批次2（n=879）制备血浆，批次3（n=363）和批次4（n=696）制备血清，批次间无共享个体。代谢物采用UPLC I-Class Plus与Q Exactive高分辨串联质谱分离鉴定，并经BMDB匹配。血浆两批分别鉴定2,946和3,206种代谢物、重叠927种；血清两批分别鉴定2,523和3,972种、重叠1,260种。研究比较MIRTH、PIXANT、EM、KNN和RF五种插补方法，设置批次内掩蔽10%/30%/50%、加入同组织另一批训练、跨批次掩蔽重叠代谢物3类场景，以相关系数和归一化均方根误差（NRMSE）评估并重复5次。下游对5个产奶性状开展代谢物-性状关联分析，比较原始与RF插补10%/30%数据。
研究结果
3个设计场景中的插补性能：场景1在4个批次中随机选取100个个体，分别掩蔽10%、30%、50%代谢物，用同批其余个体训练。结果显示所有方法准确率随缺失率升高而下降，RF和KNN对缺失率变化较不敏感；各缺失率和批次平均相关系数MIRTH_rank为0.67、PIXANT为0.55、EM为0.38、KNN为0.47、RF为0.68，RF的NRMSE最低；Batch 3样本量较小（n=363），各方法相关性较低。该场景表明批次内插补中RF总体最佳。场景2在Batch 1和Batch 3中掩蔽相同代谢物，并将同组织另一批数据加入训练；与场景1相比，所有方法相关性降低、NRMSE升高，两批三缺失率平均相关系数分别为0.36、0.34、0.36、0.39和0.60。该场景表明加入另一批数据未提升反而降低插补性能，可能与批次效应及个体生理条件差异有关。场景3在Batch 1/2和Batch 3/4中掩蔽10%、30%、50%重叠代谢物使其成为非重叠，并用本批剩余和另一批完整数据训练；跨批次插补准确率更低，MIRTH_rank、EM、KNN、RF总体平均相关系数分别为0.17、0.19、0.09和0.34，RF的NRMSE最低；PIXANT多数情况未生成结果，因依赖表型相关且重叠代谢物有限、相关较弱。该场景表明跨批次非重叠代谢物插补仍困难。
代谢物-性状关联分析：在4个队列中对脂肪率（FP）、脂肪产量（FY）、奶产量（MY）、蛋白率（PP）、蛋白产量（PY）进行代谢物全关联分析（MWAS），比较原始代谢物与RF插补10%/30%代谢物。与原始数据相比，使用插补数据显著关联检出功效明显降低，许多原始显著关联未被插补数据识别；同时插补数据识别的大量显著关联与原始数据不重叠，假阳性率高，尤其在合并两个批次的队列中更明显。该分析表明插补准确性显著影响MWAS的统计功效和错误发现率。
讨论部分指出，RF在3个场景的相关性和NRMSE两个核心指标上均优于其他方法，与RF对复杂缺失机制较稳健的认识一致；批次内插补准确率约0.57~0.73，训练集大小重要。加入另一批数据未提升性能，可能因技术变异、样本质量等批次效应和农场/泌乳阶段等生理差异带来噪声。跨批次非重叠代谢物插补准确率低（RF约0.26~0.41），可通过减少技术差异、增加重叠代谢物改善；PIXANT因依赖表型相关且参考特征不足被排除。MWAS中插补数据导致功效下降和假阳性增加，合并批次队列更明显，因此基于插补数据尤其跨批次插补的关联需谨慎解释并尽可能独立验证。实践上建议跨批次插补谨慎应用，研究设计尽量包含重叠个体或联合检测代谢物面板，若不可避免则评估插补准确性并进行敏感性分析和独立验证。研究结论翻译：研究表明，在5种代谢物插补方法（MIRTH、PIXANT、missMDA-EM、KNN-EU和RF）中，RF在多数情况下总体插补性能最佳，尤其是对批次间非重叠代谢物的插补。对于批次内插补，RF达到的插补准确率（约0.6 ～0.7）随缺失率增加而下降。对于跨批次插补，RF达到的准确率（约0.3 ～0.4）随批次间重叠代谢物数量减少而下降。研究人员还发现，使用插补代谢物数据（尤其是跨批次插补代谢物数据）时，MWAS的性能（统计功效和错误发现率）受插补准确性很大影响。这些发现提示，基于插补数据尤其是跨批次插补数据的代谢物-性状关联应谨慎解释。
