阴离子聚合物包覆的PLK1 siRNA脂质复合物的抗肿瘤活性

《RSC Pharmaceutics》：Antitumor activity of anionic polymer-coated polo-like kinase 1 siRNA lipoplexesOpen Access

　　

Polo样激酶1（PLK1）的抑制可降低肿瘤细胞增殖，因此靶向PLK1的小干扰RNA（siRNA）是癌症治疗的一种有前景的策略。尽管阳离子脂质复合物能有效地将siRNA递送至肿瘤细胞，但其应用常受限于与生物组分的非特异性相互作用。本研究评估了阴离子聚合物包覆对负载PLK1 siRNA的脂质复合物的抗肿瘤功效和基因敲低效率的影响。由11-((1,3-双(十二酰氧基)-2-((十二酰氧基)甲基)丙-2-基)氨基)-N,N,N-三甲基-11-氧代十一烷-1-铵溴化物与1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（TC-1-12/DOPE）组成的脂质复合物成功包覆了阴离子聚合物，即透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）或聚谷氨酸（PGA），电荷比（+ : ?）为1 : 2或更高。在稳定表达荧光素酶的MCF-7、SK-OV-3和SiHa细胞中，荧光素酶（Luc）siRNA脂质复合物的高基因敲低效率并未因阴离子聚合物包覆而改变，尽管与阳离子TC-1-12/DOPE脂质复合物相比，其细胞结合率较低。负载PLK1 siRNA的阴离子聚合物包覆脂质复合物显著降低了PLK1 mRNA表达水平，其细胞生长抑制效果与未包覆的阳离子脂质复合物相当。此外，与未包覆的阳离子脂质复合物相比，阴离子聚合物包覆的脂质复合物显著抑制了红细胞凝集和溶血。这些发现表明，阴离子聚合物包覆可在维持TC-1-12/DOPE脂质复合物的强效PLK1 mRNA耗竭和治疗性siRNA功效的同时，防止与红细胞的不良相互作用。

论文解读：阴离子聚合物包覆的PLK1 siRNA脂质复合物的抗肿瘤活性研究

一、研究背景与目的

RNA疗法因其在包括癌症在内的多种疾病中的治疗潜力而备受关注。RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA分子介导的转录后基因沉默机制，合成的小干扰RNA（siRNA）可通过序列特异性降解互补mRNA来有效抑制肿瘤相关基因的表达。然而，siRNA在癌症治疗中的成功应用需要足够的细胞内递送效率。siRNA易被核糖核酸酶降解，且通过细胞膜的通透性较低。脂质递送系统是siRNA递送中研究最广泛且最有前景的方法之一。阳离子脂质复合物可保护siRNA免受酶降解并促进其进入细胞质，但其正电荷会诱导与生物组分的非特异性结合，可能引起细胞毒性，并可与带负电荷的血清蛋白或红细胞形成聚集体，主要积聚在肺部，从而阻碍siRNA向肿瘤的有效递送。Polo样激酶1（PLK1）在细胞周期调控中发挥重要作用，其过表达与肿瘤进展相关，被认为是癌症治疗的有前景的靶点。本研究旨在评估透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）和聚谷氨酸（PGA）等可生物降解阴离子聚合物包覆对负载PLK1 siRNA的阳离子脂质复合物抗肿瘤功效的影响。

二、研究内容与主要结论

研究人员制备了由多种阳离子脂质与1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）以1:1摩尔比组成的阳离子脂质体，并与siRNA以4:1的电荷比（+ : ?）形成脂质复合物。在MCF-7-luc、SK-OV-3-luc和SiHa-luc细胞中，由TC-1-12/DOPE组成的脂质复合物表现出最高的荧光素酶基因敲低效率和PLK1 siRNA诱导的细胞生长抑制作用。随后，研究人员以1:0.5至1:4的电荷比（+ : ?）将TC-1-12/DOPE脂质复合物与不同分子量的HA、CS或PGA混合进行包覆。结果表明，电荷比为1:2或更高时，除PGA在1:0.5时仍保持正电位外，所有聚合物包覆的脂质复合物均表现出负的ζ-电位（?17至?47 mV），且未发生聚集。在1:2电荷比下，所有阴离子聚合物包覆的脂质复合物均保持了较高的Luc siRNA基因敲低效率，尽管CS和PGA包覆的脂质复合物与siRNA的结合率有所降低。在SK-OV-3-luc细胞中，所有包覆PLK1 siRNA的脂质复合物均显著降低了PLK1 mRNA表达水平，但CS和PGA包覆的复合物的敲低效果相对有限。细胞结合实验显示，阴离子聚合物包覆降低了脂质复合物与细胞的结合，其中HA包覆的复合物结合率降低较少，这可能与HA与细胞表面CD44受体的相互作用有关。血液相容性实验表明，阴离子聚合物包覆显著抑制了红细胞凝集并将溶血率从未包覆时的约60%降至约20%。

三、关键技术方法

本研究采用了薄膜水化法制备阳离子脂质体，通过动态光散射法测量粒径和ζ-电位，使用Quant-iT RiboGreen RNA试剂评估siRNA与脂质复合物的结合率。基因敲低效率通过荧光素酶报告基因系统和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）评估，细胞活力采用WST-8法测定，细胞结合通过流式细胞术检测Cy5标记siRNA的荧光强度，血液相容性通过小鼠红细胞凝集和溶血实验评价。

四、研究结果

3.1 阳离子脂质对Luc siRNA脂质复合物转染后荧光素酶活性的影响： 六种阳离子脂质体与siRNA形成脂质复合物后粒径为206–260 nm，ζ-电位为38.8–51.7 mV。在三种细胞系中，TC-1-12/DOPE脂质复合物均表现出最高的荧光素酶基因敲低效率，将荧光素酶活性降至未处理细胞的20%以下。

3.2 阳离子脂质对PLK1 siRNA诱导细胞生长抑制的影响： SK-OV-3-luc细胞的PLK1 mRNA表达水平为MCF-7-luc细胞的1.7倍，SiHa-luc细胞为0.8倍。TC-1-12/DOPE脂质复合物在三种细胞系中均表现出显著的PLK1 siRNA诱导的生长抑制作用。

3.3 聚合物包覆电荷比对PLK1 siRNA细胞生长抑制的影响： 在1:0.5电荷比下，HA和CS包覆导致聚集，PGA包覆未能实现电荷反转。在1:2及以上电荷比下，所有包覆的脂质复合物均保持负电位且无聚集，并维持了PLK1 siRNA诱导的细胞生长抑制效果。

3.4 聚合物包覆对脂质复合物基因敲低效率的影响： 在1:2电荷比下，所有阴离子聚合物包覆的脂质复合物在三种细胞系中均保持了较高的荧光素酶基因敲低效率。在SK-OV-3-luc细胞中，所有包覆PLK1 siRNA的脂质复合物均显著降低了PLK1 mRNA水平，但CS和PGA包覆的复合物敲低效果相对较弱。

3.5 聚合物包覆对Cy5-siRNA脂质复合物细胞结合的影响： 未包覆的阳离子脂质复合物细胞结合率最高，阴离子聚合物包覆后细胞结合率降低。HA包覆的脂质复合物结合率降低较少，CS和PGA包覆的复合物结合率降低较明显。

3.6 阴离子聚合物包覆对脂质复合物与血液组分相互作用的影响： 未包覆的TC-1-12/DOPE脂质复合物与红细胞孵育后诱导凝集和约60%溶血。HA-M、HA-H和PGA包覆抑制了红细胞凝集，所有阴离子聚合物包覆的脂质复合物溶血率均降至约20%。

五、讨论与结论

TC-1-12是一种具有C12三烷基链的阳离子脂质，其融合特性可能有助于高转染效率。阴离子聚合物包覆虽然降低了细胞结合率，但基因敲低效率未受显著影响，这可能归因于TC-1-12/DOPE脂质复合物固有的高转染效率，即使减少的细胞摄取量仍足以递送足量siRNA。阴离子聚合物包覆有效改善了脂质复合物的血液相容性，抑制了红细胞凝集和溶血。研究结论表明，阴离子聚合物包覆的脂质复合物在维持TC-1-12/DOPE脂质复合物基因沉默活性的同时改善了血液相容性，为PLK1 siRNA为基础的癌症治疗提供了有前景的工具。