一氧化氮释放型糖胺聚糖调控角膜上皮修复的潜力

《RSC Pharmaceutics》：Potential to modulate corneal epithelial repair via nitric oxide-releasing glycosaminoglycansOpen Access

　　

生物活性伤口疗法能够保护受损组织、促进再生并预防感染，有望成为传统被动治疗的有前景替代方案。本研究合成了一氧化氮（NO）释放型糖胺聚糖（GAGs），并评估了其在角膜伤口愈合中的治疗潜力。研究人员合成了低分子量和高分子量透明质酸（HA）以及不同硫酸化模式的硫酸软骨素（CS）衍生物，并对其在NO释放、抗菌活性、细胞毒性以及对人体角膜上皮细胞增殖和迁移的影响方面进行了表征。随后，利用三维角膜组织划痕闭合模型评估了体外屏障功能恢复情况。由具有持久NO释放能力的CS衍生物和具有中等NO释放动力学特性的低分子量HA组成的衍生物被确定为最有潜力的材料。HA衍生物甚至在迁移实验的后期时间点也能增强上皮细胞迁移。含有HA衍生物的羧甲基纤维素（CMC）凝胶制剂进一步促进了细胞迁移。在角膜组织模型中，游离形式和CMC配制的NO释放型HA处理均增强了组织修复。跨上皮电阻测量所反映的屏障恢复证实了损伤后组织完整性的重建，同时伴随与促伤口愈合相关的细胞因子环境变化。总体而言，CMC凝胶制剂中的NO释放型低分子量HA代表了一种促进角膜伤口修复的有前景的生物活性策略。

研究背景

全球约有5500万人遭受眼外伤，其中超过1900万例导致永久性视力损伤。角膜承担眼睛70%的屈光力，角膜损伤威胁视力。受伤后，角膜通过再上皮化封闭创口，随后经历止血、炎症、增殖与迁移以及重塑四个重叠的伤口愈合阶段。愈合过程的异常可能导致角膜缺损，降低视力。初始护理决定了伤后视力保留水平。感染和过度或未消退的炎症会延缓愈合并增加失明风险。目前局部或全身抗生素用于控制感染，抗炎药物调节炎症，但角膜上皮紧密连接和血-房水屏障限制了药物递送至眼内，疗效降低。传统抗生素还面临耐药性问题。因此，兼具抗菌、抗炎并支持组织再生的多模式治疗对于改善角膜愈合具有重要意义。一氧化氮（NO）是一种内源性自由基，其浓度依赖性生物活性使其外源性递送在角膜伤口愈合中具有前景。低浓度NO促进伤口愈合活性，高浓度NO产生广谱抗菌效应，且不易诱导细菌耐药。糖胺聚糖（GAGs）是一类生物聚合物，透明质酸（HA）和硫酸软骨素（CS）因在角膜中天然存在而备受关注。HA具有分子量依赖的活性，低分子量HA在受损组织中表达并显示促炎和促血管生成特性，还可促进角膜上皮细胞迁移并延长眼科药物的生物利用度。CS的治疗效果主要由硫酸化模式决定。鉴于NO和GAGs的促伤口愈合特性，将两者结合作为多模式治疗策略在角膜伤口愈合应用中具有重要研究价值。局部给药是首选途径，但眼部快速清除限制了药物滞留，高粘度凝胶滴剂可增强眼表滞留。

研究方法

研究人员首先合成了胺修饰的GAGs，包括低分子量HA（HA90，80–110 kDa）、高分子量HA（HA1000，1.0–1.5 MDa）、硫酸软骨素A（CSA）和硫酸软骨素C（CSC），分别使用三种含二级胺的烷基胺（DETA、DPTA、HEDA）进行修饰。随后通过加压NO气体反应将N-重氮烯二醇盐NO供体连接到胺修饰的GAGs上，制备NO释放型GAGs。采用化学发光法实时监测NO释放动力学。体外评估包括：最小杀菌浓度（MBC）测定（针对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌）；人角膜上皮细胞（HCE-2）的细胞毒性（刃天青法测定半数抑制浓度IC₅₀）；细胞迁移实验（划痕闭合模型，监测0–48小时伤口面积变化）；细胞增殖实验（每日处理，72小时后检测代谢活性）。基于筛选结果，选择HA90-DPTA/NO作为先导候选物，将其掺入3% w/v羧甲基纤维素（CMC，250 kDa）硼酸缓冲盐水凝胶中，制备三种浓度的局部凝胶制剂（最终HA90-DPTA/NO浓度为33、100、300 μg mL^?1，CMC为0.3% w/v）。对制剂进行了流变学性质、NO释放、光学透明度、pH稳定性和无菌性表征。最后，在三维EpiCorneal人角膜组织模型中，通过机械划痕制造伤口，用游离或制剂的HA90-DPTA/NO处理5天，每天测量跨上皮电阻（TEER）评估屏障恢复，并在第1、3、5天收集基底上清液进行细胞因子谱分析（检测IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α）。

研究结果

3.1 胺修饰和一氧化氮释放型糖胺聚糖：傅里叶变换红外光谱（FTIR）和元素分析确认了烷基胺成功共价连接到GAGs上。NO释放动力学受烷基胺类型影响，DETA修饰的衍生物释放持续时间最长和半衰期最长，其次为DPTA和HEDA。HA的NO载量依赖于分子量，HA90衍生物（0.39–0.45 μmol mg^?1）高于HA1000衍生物（0.25–0.29 μmol mg^?1）。CS的硫酸化模式不影响NO载量，CSA和CSC衍生物均约为0.5 μmol mg^?1。

3.2 角膜伤口愈合的体外分析：

3.2.1 抗菌活性：未修饰和胺修饰的GAGs无抗菌活性。所有NO释放型GAGs均表现出抗菌活性，MBC范围为2–8 mg mL^?1。CS衍生物的杀菌效果优于HA衍生物，HA90衍生物抗菌活性优于HA1000衍生物。按总NO载量归一化后，杀菌浓度在15–70 μg mL^?1 NO之间。

3.2.2 细胞活力：未修饰GAGs几乎无细胞毒性。DPTA修饰引入了不同程度的细胞毒性，HA90-DPTA、CSA-DPTA和CSC-DPTA的IC₅₀分别为11.0 ± 0.5、2.2 ± 0.1和5.3 ± 0.3 mg mL^?1。引入NO供体后，所有衍生物的IC₅₀降至1–2 mg mL^?1。

3.2.3 细胞增殖和迁移：在非毒性浓度下，10 μg mL^?1的CSA-DETA/NO在12小时和HA90-DPTA/NO在48小时显著缩小了细胞间隙。HA衍生物处理后细胞增殖保持约80%，仅HA1000-DETA/NO在高浓度抑制增殖。CS衍生物处理后增殖保持在90%以上，仅CSC-DPTA/NO在高浓度抑制增殖。

3.3 制剂开发和体外评估：

3.3.1 制剂开发：CMC凝胶表现出理想的剪切稀化行为，掺入HA90-DPTA/NO后保持了流变学性质，冻融循环后稳定性良好。NO释放总量与游离HA90-DPTA/NO相当。制剂光学透明，pH在7.3–7.4范围内稳定，无菌性得到确认。

3.3.2 制剂的体外分析：不含HA90-DPTA/NO的制剂本身不降低细胞活力，含HA90-DPTA/NO的制剂维持约90%的细胞活力。在迁移实验中，与未处理对照相比，各浓度制剂的处理在24小时均增加了细胞向无细胞间隙的迁移。

3.4 三维人角膜伤口愈合组织模型：机械损伤后TEER从约1500 Ω降至200 Ω。游离HA90-DPTA/NO处理在第4天所有浓度均显著提高TEER，第5天仅300 μg mL^?1组显著更高。制剂单独处理在第4和第5天TEER显著高于未处理对照。掺入HA90-DPTA/NO的制剂进一步增强了TEER，300 μg mL^?1组从第2天开始持续改善，第3天达到损伤前水平并显著高于其他组。与游离形式相比，制剂形式加速了屏障恢复。细胞因子分析显示，损伤诱导所有四种细胞因子在24小时内急剧升高。游离HA90-DPTA/NO处理在第1天，33和100 μg mL^?1增加IL-6表达，33 μg mL^?1增加IL-10表达，各浓度均降低IFN-γ和TNF-α表达，其中300 μg mL^?1效果最显著。第3天，33 μg mL^?1仍维持IL-6和IL-10高水平，100和300 μg mL^?1降低IFN-γ和TNF-α。第5天，IL-6和IL-10恢复到基线水平，300 μg mL^?1仍显著降低TNF-α。制剂形式的HA90-DPTA/NO比游离形式更有效地诱导了促伤口愈合的细胞因子环境。

总结与结论

本研究合成了一系列NO释放型GAGs，通过改变GAG类型、分子量和硫酸化模式以及烷基胺结构，实现了不同的NO释放动力学。体外筛选确定了HA90-DPTA/NO（低分子量HA经DPTA修饰并负载NO）作为最具潜力的先导候选物，因其具有适中的NO释放半衰期、良好的抗菌活性、可接受的细胞毒性以及在迁移实验中后期时间点促进上皮迁移的能力。将该候选物掺入CMC凝胶制剂后，制剂保持了良好的物理化学性质和生物相容性，并在二维细胞迁移和三维角膜组织模型中均显示出比游离形式更强的促愈合效果。在三维角膜组织模型中，制剂处理的TEER恢复更快，且伴随有利于伤口愈合的细胞因子谱变化（如降低促炎因子IFN-γ和TNF-α）。研究结论表明，CMC凝胶制剂中的NO释放型低分子量HA（HA90-DPTA/NO）是一种有前景的促进角膜伤口修复的生物活性策略，其多模式作用机制（抗菌、免疫调节和促上皮迁移）可能优于传统单一疗法。