《RSC Pharmaceutics》：PEGylated oligonucleotide hybridization improves intracellular stability of lipid nanoparticle-delivered mRNAOpen Access
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改善细胞内mRNA稳定性是mRNA疗法开发中的一个关键挑战，因为快速细胞内降解限制了蛋白质表达的持续时间。然而，使用脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）实现细胞内mRNA保护具有挑战性，因为脂质成分可能并入细胞膜区室并在细胞质中与
改善细胞内mRNA稳定性是mRNA疗法开发中的一个关键挑战，因为快速细胞内降解限制了蛋白质表达的持续时间。然而，使用脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）实现细胞内mRNA保护具有挑战性，因为脂质成分可能并入细胞膜区室并在细胞质中与mRNA分离。为应对这一挑战，研究人员采用RNA寡核苷酸杂交策略，通过将mRNA与聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）偶联的RNA寡核苷酸杂交，将保护性分子稳定附着于细胞质中的mRNA。在优化PEG链的数量和长度的过程中，LNPs成功包封了甚至带有大量长PEG链的mRNA，且对其理化性质影响很小。在培养细胞中，带有少量短PEG链的mRNA比非PEG化mRNA对照表现出更高的蛋白质表达，而随着PEG链数量和长度的增加，这种增强作用消失。机制分析显示，高密度的长PEG链降低了LNPs的血清稳定性，从而减少细胞摄取。相反，少量短PEG链保持了LNP稳定性和细胞摄取效率，同时有效保护mRNA免于细胞内降解。总之，本研究通过杂交将保护性分子直接附着于mRNA，成功实现了LNP递送mRNA的细胞内稳定化。
信使RNA（mRNA）作为一种治疗平台，在疫苗、蛋白质替代和基因调控方面具有广阔前景，但胞内mRNA快速降解限制了蛋白表达持续时间。脂质纳米颗粒（LNP）是最广泛研究的递送载体，然而LNP中的脂质成分在进入细胞质后容易融入细胞膜区室，失去与mRNA的关联，因此难以在胞内保护mRNA。已有的mRNA工程策略包括修饰核苷、优化5′帽和poly(A)尾、调整非翻译区（UTR）和密码子等，但直接为mRNA附着保护性分子可能提供额外机制。研究人员采用RNA寡核苷酸杂交方法，将聚乙二醇（PEG）偶联的寡核苷酸（PEG–OligoRNA）与mRNA杂交，以实现胞内mRNA保护。
研究人员设计了17-nt的PEG–OligoRNA，与mRNA特定位置杂交，然后包封于ALC-0315基LNP中。通过改变PEG链长度（2 kDa和12 kDa）和数量（1、2、4、7个），优化了PEG化程度。研究发现，LNP能够包封大量长PEG链的mRNA，但高密度长PEG链降低LNP血清稳定性，减少细胞摄取；而少量短PEG链保持LNP稳定性，同时有效保护mRNA免于胞内降解，将蛋白表达提高至11.9倍。这项工作证明了通过杂交直接附着保护分子可实现LNP递送mRNA的胞内稳定化。
主要关键的技术方法：研究人员合成了与fLuc mRNA上7个预定位置互补的17-nt PEG–OligoRNA（PEG2k和PEG12k），通过加热冷却进行杂交，凝胶电泳确认杂交成功。LNP采用乙醇稀释法由ALC-0315、DSPC、胆固醇和ALC-0159制备（摩尔比46.3:9.4:42.7:1.6）。表征方法包括动态光散射（DLS）、ζ电位、RiboGreen法测包封率、荧光关联光谱（FCS）测每LNP mRNA数。细胞实验使用DC2.4小鼠树突状细胞和HeLa人宫颈癌细胞（购自Riken BioResource Center）。功能评估包括荧光素酶报告基因表达、CCK-8活力、流式细胞术测细胞摄取、共聚焦显微镜测内体逃逸、FRET测血清稳定性、qPCR测胞内mRNA稳定性。统计用单因素方差分析。
在结果部分，研究人员首先通过凝胶电泳确认了PEG–OligoRNA与mRNA成功杂交。DLS显示所有LNP粒径约60–80 nm，PDI<0.2，ζ电位近中性，且在4°C储存2周稳定。RiboGreen测定包封率：非PEG化约90%，PEG2k修饰后仍>80%，PEG12k修饰后最低约70%。FCS显示每LNP平均mRNA分子数从约4降至约2.5（七条PEG12k）。说明LNP具有高包封PEG化mRNA的能力。
在蛋白表达效率方面，DC2.4细胞中，一个PEG2k–OligoRNA修饰的mRNA在4小时时荧光素酶表达比对照高11.9倍；24小时时，1或2个PEG–OligoRNA（2k或12k）修饰的mRNA均显著高于对照。在HeLa细胞中，1或2个PEG2k及2个PEG12k修饰在24小时显著提高表达。细胞活力实验排除了细胞毒性的影响。
在血清稳定性研究中，通过FRET评估LNP在50% FBS中的稳定性。七条PEG12k修饰的LNP在0分钟时FRET效率即降低；随着PEG数量和长度增加，FRET效率下降更明显，表明过多PEG链破坏LNP在血清中的结构稳定性。而一条PEG2k修饰保持与对照相当。
在细胞摄取与胞内运输研究中，流式细胞术显示，增加PEG数量或长度减少两种细胞系的摄取，与血清稳定性趋势一致。BCA法显示蛋白质冠没有减少反而增加，说明不是隐性屏蔽所致。共聚焦显微镜显示2 kDa PEG修饰轻微抑制内体逃逸，但蛋白表达仍增强，表明增强不依赖于内体逃逸。
在细胞内稳定性研究中，qPCR分析显示，非PEG化mRNA在1小时剩约10%，而1或2个PEG2k修饰的mRNA保留约20%，且在2小时有显著差异。说明少量PEG2k–OligoRNA杂交改善胞内mRNA完整性，延迟降解。由于检测的是总RNA，无法区分内体/胞质降解，但结合蛋白表达时间点，支持胞内保护机制。
讨论部分指出，PEG–OligoRNA杂交增强蛋白表达可归因于胞内保护，且PEG–OligoRNA可能从mRNA解离，因此保护作用仅持续数小时。提高PEG数量或长度会降低LNP稳定性，从而抵消保护效应。研究结论翻译如下：本研究表明，PEG–OligoRNA杂交能够保护mRNA免于细胞内降解，并增强LNP介导的mRNA递送中的蛋白表达。通过杂交策略使保护分子与mRNA更稳定地关联。尽管包封大量长PEG链会破坏LNP在血清中的稳定性并降低细胞摄取，但在mRNA上引入少量短PEG链可提供平衡：既最小化LNP的胞外失稳，又维持胞内mRNA保护。因此，该方法在晚期时间点增强蛋白表达，提示改善的胞内稳定性有助于延长蛋白表达。该杂交策略与现有mRNA稳定性策略作用机制不同，可能产生协同效应。
