基于1H NMR代谢组学的土耳其有机百里香蜂蜜特征性芳香代谢物解析

《Journal of Food Composition and Analysis》：1H NMR-based metabolomic characterization of Turkish organic thyme honey reveals distinctive aromatic metabolite features

　　

基于1H NMR的代谢组学表征揭示了土耳其有机百里香蜂蜜独特的芳香代谢物特征。 • 1H NMR代谢组学揭示了土耳其有机百里香蜂蜜独特的指纹图谱。 • 有机百里香蜂蜜与百里香花蜜及百花蜜被明确区分。 • 芳香族及酚类相关化合物是蜂蜜区分的关键贡献因素。 • 酪氨酸（Tyrosine）、苯乙酸（Phenylacetate）、犬尿喹啉酸（Kynurenate）及3-苯基乳酸（3-Phenyllactate）被提议作为候选标志物。

一、研究背景与问题提出

单花蜜因其源自单一植物来源而通常被视为高价值产品，其成分受花源和地理起源的强烈影响，这一关系反映在与蜂蜜区分和真实性评估相关的香气挥发性化合物中。然而，由于挥发性成分可能受采收季节、储存条件、热处理、蜜蜂代谢及分析方法学等因素影响，普遍可靠的化学标志物的识别仍然困难。因此，单花蜜的表征不应依赖单一分析参数，而应基于植物学、理化及化学数据的综合评价。

在地中海地区的蜂蜜类型中，百里香蜂蜜是最具特色且价值最高的单花蜜之一，主要产自希腊、意大利、摩洛哥、土耳其和西班牙。在希腊，百里香蜂蜜约占年产量的10%，其市场价格可达其他蜂蜜的2至3倍，凸显其经济重要性。在土耳其，百里香蜂蜜主要在安纳托利亚西南部生产，尤其是穆拉省（Mu?la）的达特恰（Dat?a）和马尔马里斯（Marmaris）地区。尽管具有区域和商业重要性，土耳其百里香蜂蜜的化学研究相较于其他地中海单花蜜仍十分有限。已有研究主要基于理化分析、花粉分析、挥发性成分谱、酚类组成或生物活性测定，但迄今为止尚无研究将NMR代谢组学应用于土耳其有机百里香蜂蜜，也未直接将其代谢指纹与非有机百里香优势蜜及多花蜜进行比较。

二、研究内容与结论

研究人员利用1H NMR波谱技术对土耳其有机百里香蜂蜜进行了代谢组学表征，共纳入25个样本，包括7个有机百里香蜂蜜样本、6个百里香花蜜样本、11个非单花蜜的百花蜜样本及1个百里香水样本。蜂蜜样本均来自土耳其穆拉省达特恰和马尔马里斯地区，于2025年中采集。有机百里香蜂蜜样本为经土耳其共和国农林部有机农业法规认证的有机产品。

研究通过定量1H NMR分析鉴定了45种代谢物，并采用单因素方差分析（ANOVA）结合Benjamini-Hochberg错误发现率校正进行组间比较，同时运用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行多元统计区分。结果表明，有机百里香蜂蜜具有独特的代谢指纹，其主要特征包括：果糖和葡萄糖浓度最高（分别为703 mM和540 mM）；脯氨酸（Proline）含量尤为丰富（3.2 mM）；多种氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸等）和有机酸（乙酸、乙酰乙酸、丙酮、柠檬酸、甲酸、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸等）水平显著升高；尤其值得注意的是芳香族及酚类相关化合物的富集，其中酪氨酸（713.03 μM vs. 21.56 μM和25.73 μM）、苯乙酸、犬尿喹啉酸和苯甲酸经FDR校正后差异仍具统计学显著性。PLS-DA分析显示，有机百里香蜂蜜与其他蜂蜜样本可清晰分离，两分组模型R2=0.79，Q2=0.71；三组比较（有机百里香蜜、百里香花蜜、百花蜜）中，苯丙氨酸、麦芽糖、果糖、乙醇、天冬氨酸等为主要判别变量。排除糖类后的敏感性分析表明，预测判别能力在去除麦芽糖、葡萄糖、果糖和蔗糖后仍得以保留（Q2=0.578，平衡准确率81.3%，AUROC=0.938），酪氨酸、脯氨酸、缬氨酸和亮氨酸在两种缩减模型中均位列前四VIP变量。

三、主要关键技术方法

本研究主要采用1H NMR波谱技术（500 MHz Bruker Ascend波谱仪，配备Avance NEO控制台和室温BBO双共振探头，使用noesygppr1d一维NOESY预饱和脉冲序列，25 °C下采集，32 K复杂数据点，谱宽9615.4 Hz，8 K次扫描），结合Chenomx NMR Suite 12.01软件进行代谢物定性与定量分析（以DSS为内标）。统计方法包括经典单因素方差分析（Welch统计量，Benjamini-Hochberg FDR校正）和MetaboAnalyst 6.0平台的PLS-DA多元分析（立方根变换后Pareto缩放）。样本来源为土耳其穆拉省达特恰和马尔马里斯地区的25个样本。

四、研究结果

4.1 土耳其有机百里香蜂蜜的代谢物组成显示芳香族及其他次要代谢物的差异

定量1H NMR分析鉴定了包括主要糖类、有机酸、氨基酸、芳香族化合物及其他低分子量成分在内的多种代谢物。有机百里香蜂蜜的果糖和葡萄糖平均浓度最高，分别为703 mM和540 mM。有机酸方面，苹果酸在有机百里香蜂蜜中达645 μM，显著高于百里香花蜜（373 μM）和百花蜜（352 μM）。氨基酸方面，脯氨酸尤为丰富（3.2 mM vs. 1.3 mM和1.2 mM）。最显著的差异体现在芳香族及酚类相关化合物：酪氨酸在有机百里香蜂蜜中达713.03 μM，而百里香花蜜和百花蜜仅为21.56 μM和25.73 μM；苯甲酸（q=0.0016）、犬尿喹啉酸（q=0.0198）、苯乙酸（q=0.0443）和酪氨酸（q=0.0025）经FDR校正后差异均具统计学显著性。3-苯基乳酸虽均值较高但未达显著（q=0.0783）。

4.2 蜂蜜样本的NMR波谱指纹

堆叠1H NMR谱图显示，最强共振位于约3.0至5.5 ppm区间，主要对应碳水化合物信号（果糖和葡萄糖）。扩大的低强度区域（约6.0至9.0 ppm）揭示了芳香族及酚类相关化合物的特征信号，其中3-苯基乳酸和苯乙酸在6.8至7.2 ppm区域的特征性芳香共振以星号标示。这些次要信号虽丰度低于糖类共振，但为区分百里香蜂蜜与其他花蜜提供了有价值的信息。

4.3 有机百里香蜂蜜与其他花蜜的化学计量学区分

两分组PLS-DA分析显示有机百里香蜂蜜（绿色簇）与其他蜂蜜样本（红色簇）沿第一主成分（解释42.4%变异）清晰分离，第二主成分解释10.4%变异。VIP评分图中，麦芽糖VIP值最高，其次为酪氨酸、葡萄糖、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蔗糖、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙酮、胆碱、赖氨酸、丙酮酸和丙氨酸。三维PLS-DA得分图进一步确认了在多成分空间中的分离。完整模型嵌套交叉验证Q2=0.711，平衡准确率90.3%。

4.4 有机百里香蜂蜜、百里香花蜜和百花蜜的多组判别

三组PLS-DA分析中，第一主成分解释35.1%变异，第二主成分解释13.7%。有机百里香蜂蜜（绿色）主要位于第一主成分负侧，百里香花蜜（蓝色）主要位于正侧，百花蜜（红色）分布于两者之间。VIP评分图中苯丙氨酸得分最高，其次为麦芽糖、果糖、乙醇、天冬氨酸、岩藻糖、苏氨酸、柠檬酸、脯氨酸、乙酰胺、琥珀酸、异亮氨酸、苯乙酸、酪氨酸和乙酸。芳香族相关化合物（苯丙氨酸、苯乙酸、酪氨酸）的贡献支持了酚类相关化合物对百里香蜂蜜化学特征定义的核心作用。

4.5 与麦卢卡蜂蜜的比较及蜜蜂加工在百里香蜂蜜形成中的作用

麦卢卡蜂蜜以其特定标志物（甲基乙二醛、二羟基丙酮、leptosperin、丁香酸甲酯、苯乳酸、对羟基苯乳酸）定义。有机百里香蜂蜜虽与麦卢卡蜂蜜不含相同标志物，但两者均依赖植物来源的芳香族和酚类相关代谢物实现其独特性。百里香水样本的NMR谱图较蜂蜜简单得多，主要碳水化合物共振及多数氨基酸、有机酸和芳香族代谢物信号缺失或极弱，表明蜜蜂加工（水分去除、酶促转化、生化变化）对最终蜂蜜代谢组的形成具有重要影响，但当前数据无法区分浓缩效应与特定生化转化。

五、讨论与结论

讨论部分指出，有机百里香蜂蜜的化学独特性主要体现在次要代谢物组分而非主导糖类。这一发现与此前关于百里香蜂蜜挥发性成分的研究一致：Alissandrakis等（2007）报道希腊百里香蜂蜜以苯乙醛为最丰富挥发性化合物；Mannas和Altu?（2007）提出3,4,5-三甲氧基苯甲醛作为可能的标志物。与麦卢卡蜂蜜的比较表明，百里香蜂蜜可能拥有自身特有的标志物体系，酪氨酸、苯乙酸、犬尿喹啉酸、3-苯基乳酸及未指派的芳香区NMR信号可作为未来标志物发现的起点。生物活性方面，Charalambous等（2017）的随机对照可行性试验报道百里香蜂蜜对头颈癌患者治疗诱导的口干症具有积极效果；Kassi等（2014）从百里香蜂蜜相关单萜中分离出具有凋亡活性和抗菌活性的化合物；Gohar等（2021）报道百里香蜂蜜蛋白制备物可抑制活化人多形核白细胞的活性氧产生。

研究结论为：土耳其有机百里香蜂蜜在所研究样本集中显示出与对照蜂蜜的1H NMR代谢物谱组间差异。探索性PLS-DA分析（包括糖类排除敏感性分析）表明，在去除指定糖类后两分类比较的预测判别能力得以保留。酪氨酸、苯乙酸和犬尿喹啉酸水平的升高，连同芳香区特征性低强度NMR信号，提示芳香区代谢物可能对百里香蜂蜜的化学特征有所贡献。然而，由于样本数量有限、缺乏独立植物学验证和外部验证队列，且基于非靶向一维1H NMR分析，这些发现尚不能确立有机百里香蜂蜜的普适化学特征或真实性检测方法。更大规模、地理均衡、独立认证的样本集及补充靶向分析将有助于确认候选代谢物的可重复性和特异性。