《The Journal of Molecular Diagnostics》：Ultrafast Workflow for Accurate Full-length
ABO Genotyping using Nanopore Sequencing
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快速解决ABO不符对输血安全至关重要。然而，当前短读长测序无法跨越21.9 kb ABO基因进行相位解析。本研究旨在开发基于纳米孔测序的全长ABO基因分型工作流程。研究人员采用长距离PCR（LR-PCR）扩增跨越ABO基因的扩增子，来源于63例血清学不符献血者
快速解决ABO不符对输血安全至关重要。然而，当前短读长测序无法跨越21.9 kb ABO基因进行相位解析。本研究旨在开发基于纳米孔测序的全长ABO基因分型工作流程。研究人员采用长距离PCR（LR-PCR）扩增跨越ABO基因的扩增子，来源于63例血清学不符献血者基因组DNA，并使用Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台测序。以PacBio HiFi测序作为正交参考标准。使用统一生物信息学流程进行变异检测和单倍型重建。该工作流程进一步在另一种纳米孔测序平台PolySeq上评估，其测序准确性低于ONT R10.4化学。本研究中，280,712名献血者中的63例不符样本产生126条全长单倍型。纳米孔工作流程在6小时内给出结果，而PacBio超过46小时。ONT在非同聚物（homopolymer）区域与PacBio HiFi显示100%一致性。92.06%样本中因果变异得到解析。同聚物错误局限于内含子1且无表型影响。PolySeq平台在应用基于深度学习的纠错后也产生与PacBio相当的共识准确性，并具有更高的嵌合体（chimerism）灵敏度，确认了该工作流程的稳健性。总之，该超快速纳米孔工作流程实现同日全长ABO单倍型解析，为精准输血（precision transfusion）提供快速、成本有效的复杂变异基因分型解决方案，并有助于全球单倍型数据库发展。
ABO血型系统对输血安全具有重要临床意义，但其遗传复杂性导致血清学不符的准确解析仍具挑战。传统方法中，序列特异性引物PCR（PCR-SSP）仅检测预设单核苷酸多态性，遗漏脱靶突变且不能定相；Sanger测序分型可解析外显子但杂合子存在相位歧义并常需克隆；短读长下一代测序（NGS）可改善定相并检测内含子复杂变异，但周转时间通常4–7天、批量化成本结构不适合输血场景的紧急单样本检测，且将单核苷酸变异（SNV）分配至特定等位基因模式仍受限。长读长测序（LRS）可跨越整个ABO位点，实现直接单倍型定相和结构变异检测；ONT具有实时测序、快速流程（<6小时）和便携设备超长读长，但历史原始读长准确性较低（QV～Q20）和成本限制临床采用；PacBio HiFi准确性高但运行时间长（～46小时）、DNA输入量高和成本高，不适合紧急临床决策。尽管各LRS平台在准确性、速度、成本和采用方面存在权衡，仍缺乏标准化、超快速、经临床验证的全长ABO单倍型解析流程。为此，研究人员开发了基于纳米孔测序的超快速工作流程，可在约6小时内完成全长ABO基因分型，并以PacBio HiFi作为正交基准，同时评估PolySeq平台用于不同纳米孔平台间的共识级结果比较。
关键方法概括：样本来自深圳市血液中心2022年1月至2023年12月280,712名无偿献血者，按AABB指南筛选63例血清学不符样本。提取基因组DNA后，采用一步长距离PCR（LR-PCR）扩增chr9:133255646-133277146约21.9 kb的ABO位点；同一扩增产物分别用于ONT R10.4、PacBio HiFi和PolySeq测序，PacBio HiFi作为正交参考。统一生物信息学流程进行质控、比对、DeepVariant变异检测、单倍型聚类和全长共识序列组装；PolySeq数据另经深度学习纠错；并评估空白限（LOB）。
3.1 队列特征与血清学分型：在280,712名常规献血者中，63例（0.022%）表现出血清学不符且经扩展正反定型不能解决。基于综合血清学检测，这些样本分为五类：弱/无红细胞反应30例、额外红细胞反应13例、弱/无血清反应15例、额外血清反应4例、混合红细胞反应1例。研究人员采用LR-PCR联合多平台长读长测序研究其遗传基础。结论是该队列为血清学不符样本的遗传解析提供了明确表型分类。
3.2 全长ABO基因扩增与三代测序工作流程：所有63例不符样本均通过优化LR-PCR成功扩增约21.9 kb的完整ABO基因位点，获得适合长读长测序的高质量扩增子，并随后在ONT和PacBio HiFi平台测序。整合流程中DNA提取约15分钟、LR-PCR 3小时、ONT建库和测序约2小时，每批样本约6小时完成；PacBio建库、测序和碱基识别约需46小时，且因芯片不可重复使用和批处理限制周转时间延长至数天。结论是该纳米孔工作流程具备超快速周转优势。
3.3 基于纳米孔测序的ABO单倍型解析：研究人员建立整合生物信息学流程，对PromethION 2S原始reads进行质量过滤、Minimap2比对、DeepVariant检测SNV、Python脚本聚类候选单倍型，并用Flye组装每个单倍型簇的全长共识序列，实现外显子和内含子区域全面重建。63例样本均生成全长单倍型；58例（92.1%）识别因果变异，包括52个编码区变异等位基因（34个已知亚型和18个新等位基因）、4例结构异常（3例重组和1例嵌合体）、2例深内含子变异（c.28+5860A>G、c.28+5875C>T）。其余5例未检测到因果变异，均为弱/无血清反应表型。结论是纳米孔测序可解析复杂ABO单倍型及结构变异。
3.4 PacBio HiFi测序的单倍型验证：以PacBio HiFi作为正交基准，ONT与PacBio HiFi在所有外显子和调控变异中显示100%一致。比较全长ABO序列（外显子、内含子、5’-UTR、3’-UTR）发现，同聚物区域是平台间差异的唯一来源；ONT与PacBio差异仅位于内含子1，所有非同聚物区域完全一致。ONT在同聚物长度超过15个碱基时出现双向长度错误，且不一致率随同聚物长度增加而升高；PacBio重复测序相同样本时在同聚物区域也出现约±1 bp变异。ABO编码区最长同聚物为外显子7的7个连续鸟嘌呤，这些特征不太可能影响纳米孔ABO基因分型准确性。结论是平台差异局限于内含子1同聚物且无表型影响。
3.5 PolySeq纳米孔平台ABO基因分型准确性评估：PolySeq原始碱基准确性约Q15，低于ONT，但其数据可用同一生物信息学流程处理并实现一致的单倍型解析。PolySeq的Q分数与ONT相当（p=0.14），但低于PacBio（p<0.0001）。经深度学习纠错后的PolySeq共识序列在关键临床变异位点与PacBio参考数据约100%一致。空白限（LOB）分析显示平台间差异显著（F=18.67，p<0.001），PolySeq平均LOB为2.46%±0.15%，显著低于ONT的2.67%±0.71%（p=0.023）和PacBio的2.83%±0.21%（p<0.0001）；研究中1例嵌合样本的嵌合水平高于该经验性LOB，确认了检测能力。与ONT双向错误不同，PolySeq在≥9个相同碱基区域系统性产生1–2 bp缺失，错误频率与同聚物长度负相关（如c.28+4661的9-polyT准确率91.89%，c.28+7433的14-polyA准确率1.35%）。结论是PolySeq经纠错后可在关键位点达到PacBio相当准确性，并具有较低LOB。
3.6 数据可用性：支持本研究结果的数据已存入中国国家基因库数据库（CNGBdb）的CNGB序列归档（CNSA），登录号为CNP0008822；原始数据和材料可向通讯作者合理索取。
讨论部分总结：ABO血型系统对输血安全至关重要，其遗传复杂性持续带来诊断挑战；常规血清学分型在0.022%（63/280,712）献血者中未能解决不符，传统测序方法虽已编目大量ABO等位基因，但在大结构变异检测和表征方面仍受限。本研究建立超快速纳米孔工作流程，将LR-PCR与实时测序和开源生物信息学整合，约6小时给出定相单倍型，较传统NGS（4–7天）和PacBio HiFi（>46小时）显著缩短，具有满足输血场景紧急临床需求的潜力。研究主要发现是ONT R10.4和PolySeq与PacBio HiFi在所有临床相关外显子和调控变异中100%一致；观察到的差异仅位于内含子1同聚物区域，这些位点位于编码和调控区域之外，不太可能影响ABO糖基转移酶功能或表型解释，共识抛光和单倍型感知算法可降低其影响，本研究中无临床决策受同聚物变异影响。PolySeq虽原始碱基质量较低，但流程仍可靠，与近期PolySeq用于CD36基因测序的研究一致；PolySeq在已知低频变异 spike-in 实验中显示较ONT和PacBio更高的低频率嵌合信号检测灵敏度，可稳定识别低于0.1%等位基因频率的变异。LR-PCR步骤稳健，21.9 kb扩增子在所有样本中成功生成，等位基因频率平衡（36–64%）且覆盖均匀，有效解决等位基因丢失和扩增偏倚担忧。纳米孔测序在58/63例中解析因果变异，包括已知和新等位基因、重组及深内含子变异；直接定相完整单倍型可识别短读长方法常遗漏的交叉断点和杂合等位基因等结构特征；1例确认的嵌合信号进一步说明检测复杂遗传模式的能力；5例未解决（7.9%）均为弱/无血清反应表型，可能涉及非ABO遗传、表观遗传或转录后机制，提示遗传聚焦方法的局限并需进一步整合组学研究。多平台比较确定同聚物区域是唯一不一致来源，非编码区外显子和调控区100%一致；ONT在同聚物≤15个碱基时保持较高准确性，较长片段出现双向错误；PolySeq在≥9个相同碱基片段系统性低估长度；这些错误仅位于内含子1且不在核心调控区，预期不影响抗原表达，外显子中>9 bp同聚物罕见，因此PolySeq在这些区域灵敏度降低不应实质性影响ABO基因分型效用。临床实施时实验室须确保实验室自建检测（LDT）符合CLIA 1988（Section 493.1253 (b)）标准并能识别常见ABO变异；讨论部分强调新等位基因发现对全球ABO单倍型数据库和精准匹配的需求。局限包括队列仅来自中国深圳地区献血者，可能限制新等位基因谱外推；深度学习纠错模块需在多样基因组背景和样本类型中进一步验证；将发现整合至全球数据库的物流和数据共享挑战仍待解决。
研究结论翻译：本研究提出一种超快速纳米孔工作流程，可在约6小时内从样本到结果解析全长ABO单倍型。通过将稳健的长距离PCR与实时纳米孔测序整合，研究人员建立了针对整个21.9 kb ABO位点的快速准确基因分型超快速流程，证明其常规应用于输血医学的可行性。该临床急需流程通过检测传统方法无法获得的新等位基因和结构变异，解决关键血清学不符；快速全长单倍型重建使该方法满足输血医学的时间敏感需求，并支持精准血液匹配的可扩展数据库开发。
