广泛期小细胞肺癌中三级淋巴结构的空间特征与成熟度预测免疫检查点抑制剂治疗反应

《Clinical & Translational Immunology》：Spatial and maturational characterisation of tertiary lymphoid structures predicts immunotherapy response in extensive-stage small cell lung cancer

　　

摘要 目的： 广泛期小细胞肺癌（extensive-stage small cell lung cancer，ES-SCLC）仍是一种侵袭性恶性肿瘤，对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的持久反应有限，且缺乏已确立的预测性生物标志物。本研究旨在评估接受基于ICI治疗方案的ES-SCLC患者中三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）的预后及预测价值。 方法： 在这项纳入180例初治ES-SCLC患者（后续接受基于ICI的治疗）的多中心回顾性研究中，研究人员采用H&E染色、多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence，mIF）及空间分析系统评估TLSs，以确定其预后和预测价值。 结果： 在22.2%的病例中检测到TLSs，且在单变量分析（HR = 0.365，95% CI：0.217–0.613，P < 0.001）和多变量分析（HR = 0.337，95% CI：0.199–0.569，P < 0.001）中，TLSs均与总生存期（overall survival，OS）改善独立相关。至关重要的是，TLS成熟状态与临床结局相关，携带含CD21+滤泡树突状细胞及有组织生发中心的成熟TLSs的患者，其生存期显著长于携带非成熟TLSs的患者（P = 0.0049）。除存在性之外，对ICIs有应答的患者表现出独特的空间特征，包括更高的TLS密度、更密集的免疫浸润，以及TLS驻留CD20+ B细胞、CD3+ T细胞与肿瘤细胞之间更短的距离，提示TLS内的免疫-肿瘤空间组织反映了功能性抗肿瘤参与。 结论： TLS成熟度及空间结构可能作为与接受ICI治疗的ES-SCLC患者临床结局相关的候选组织生物标志物，有必要结合SCLC分子分型进行前瞻性验证。

论文解读

一、研究背景与意义

小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）预后极差，5年生存率低于7%，且确诊时多已发生广泛转移。长期以来，依托泊苷联合铂类化疗一直是前线治疗的标准方案。2019年后，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）——特别是阿替利珠单抗（atezolizumab）和度伐利尤单抗（durvalumab）——重塑了广泛期小细胞肺癌（extensive-stage small cell lung cancer，ES-SCLC）的治疗格局，ICIs联合化疗已被确立为一线治疗的基石。然而，与单纯化疗相比，联合方案并未在客观缓解率（objective response rate，ORR）或无进展生存期（progression-free survival，PFS）上带来显著改善，且疾病复发仍不可避免，提示并非所有ES-SCLC患者均对免疫治疗敏感。

与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）不同，程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达在SCLC中未能成为可靠的预测生物标志物，肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）和肿瘤浸润淋巴细胞同样缺乏预测价值。因此，迫切需要识别能够预测ES-SCLC免疫治疗疗效的生物标志物。

三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）是在慢性炎症和持续抗原暴露条件下（如自身免疫性疾病、慢性感染、移植物排斥和癌症）在非淋巴组织中发育的有组织的淋巴聚集体。TLSs在结构上类似淋巴结，通常包含明确的B细胞区和T细胞区。成熟TLSs的特征是含有生发中心样结构，包含高内皮微静脉、滤泡辅助性T细胞和滤泡树突状细胞，与强大的抗肿瘤免疫相关；而非成熟TLSs主要由松散的B细胞和T细胞聚集体构成，滤泡树突状细胞稀少，免疫功能有限，且常富集调节性T细胞（Treg）和调节性B细胞（Breg），形成免疫抑制微环境。在黑色素瘤、NSCLC和子宫内膜癌等多种实体瘤中，TLSs的存在和密度已被证实可预测患者预后及ICI疗效。然而，TLSs能否在ES-SCLC接受ICI治疗的背景下作为预后生物标志物，此前尚属未探索领域。本研究正是基于这一空白，系统评估TLSs在ES-SCLC中的存在、成熟度、密度和空间分布及其预后和预测价值。

二、研究设计与方法

这是一项多中心回顾性研究，经山东省肿瘤医院伦理委员会批准。研究人员从三家机构（山东省肿瘤医院、山东省立医院、千佛山医院）回顾性纳入2020年11月至2024年12月期间经组织学确诊、初治且后续接受基于ICI治疗的ES-SCLC患者共180例。排除标准包括既往接受过放疗、化疗或免疫治疗，或缺乏可供分析的足够肿瘤组织。

主要技术方法包括：采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色评估TLS存在状态，由两名对患者临床特征和治疗结局设盲的病理医师独立评估；采用基于酪胺信号放大（tyramide signal amplification，TSA）的Opal系统进行多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence，mIF）染色，标记PanCK、CD3、CD8、CD20、CD21和CD23，使用Vectra Polaris系统采集多光谱图像；使用HALO软件进行图像分析、细胞定量和空间距离分析；采用Kaplan–Meier法和Cox比例风险回归模型进行生存分析。

三、研究结果

基线TLS存在与接受ICI治疗的ES-SCLC患者良好结局相关。 在180例初治ES-SCLC患者中，40例（22.2%）检测到TLSs。Kaplan–Meier分析显示，TLS阳性患者的总生存期（overall survival，OS）显著长于TLS阴性患者（中位OS：未达到 vs. 15.2个月；HR 0.365，95% CI 0.231–0.577，log-rank P < 0.001）。多变量Cox回归在校正年龄、性别、吸烟史和治疗反应后，TLS存在仍与OS改善显著相关（HR 0.410，95% CI 0.241–0.698，P = 0.001），表明TLS存在是独立的预后因素。

成熟TLS的存在与患者预后改善相关。 通过mIF鉴定TLS的微结构特征：非成熟TLSs由早期淋巴聚集体和初级滤泡样结构组成，缺乏明确的CD23阳性生发中心区室；成熟TLSs则呈现有组织的CD21阳性滤泡树突状细胞网络和明确的CD23阳性生发中心，具有清晰的B细胞滤泡和致密的CD3⁺/CD8⁺ T细胞区，类似次级淋巴器官结构。按成熟状态分层的生存分析显示，携带成熟TLSs的患者OS显著长于携带非成熟TLSs的患者（中位OS：未达到 vs. 25.8个月；P = 0.0049），表明TLS成熟状态提供了超越TLS存在本身的额外预后价值。

TLS相关免疫细胞组成区分应答者与非应答者。 基于TLS计数和免疫细胞密度（CD3⁺、CD8⁺、CD20⁺、CD21⁺、CD23⁺）进行无监督层次聚类，临床参数和治疗结局作为注释叠加。达到完全缓解或部分缓解（CR/PR）的患者表现出更高的TLS数量和更密集的免疫浸润。生存分析进一步显示，TLS内CD8⁺ T细胞密度升高与OS改善相关（P = 0.045），而CD3⁺ T细胞密度无显著关联（P = 0.35）；TLS驻留CD20⁺ B细胞（P = 0.032）和CD23⁺生发中心B细胞（P = 0.035）的高密度均与生存改善相关。

TLS相关免疫细胞的空间结构区分ICI应答者。 定量分析免疫亚群与PanCK⁺肿瘤细胞之间的最近邻距离，结果显示在CR/PR患者中，TLS内的CD20⁺ B细胞、CD3⁺ T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞与肿瘤细胞的距离显著小于PD/SD患者，其中CD20⁺ B细胞的缩短最为显著。此外，应答者在肿瘤巢和间质区域均表现出CD8⁺ T细胞和CD20⁺ B细胞显著更高的浸润密度。这些发现表明，ES-SCLC的ICI应答与独特的TLS驱动免疫结构相关，不仅取决于TLS的存在，更关键的是其驻留淋巴细胞与肿瘤细胞的接近程度及其跨肿瘤区室的强浸润。

四、讨论与结论

研究人员指出，TLSs在ES-SCLC免疫治疗背景下的预后价值此前尚未被探索。本研究首次系统性地考察了TLSs在ICI治疗的ES-SCLC中的定量密度、成熟状态和空间分布。成熟TLSs通过生发中心支持B细胞分化和成熟，产生多种抗体，其中IgG亚类可介导抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）和补体依赖性细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity，CDC），直接促进肿瘤细胞清除。B细胞抗原摄取促进滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，Tfh）成熟，进而增强CD8⁺ T细胞毒性。成熟TLSs在功能上类似次级淋巴器官，支持活跃免疫同时限制Treg和Breg等免疫抑制群体的过度浸润。

研究也存在局限性：回顾性设计可能引入选择偏倚；诊断性活检的组织体积有限，可能无法完全反映TLS的空间异质性，TLS阴性仅表示所检标本中未检出而非整个肿瘤的确定缺失；SCLC分子亚型是潜在混杂因素，免疫富集的SCLC-I表型可能有利于TLS形成，TLS存在可能部分反映该亚型的潜在生物学特性，因此TLS与临床结局的关联尚不能视为独立于分子亚型。

研究结论：TLS成熟度及TLS相关免疫细胞与肿瘤巢的空间接近性与接受免疫治疗的ES-SCLC患者的良好临床结局相关。其独立于SCLC分子亚型的预后价值有待进一步前瞻性验证。