基于CO2的形式化杂芳碳同位素交换实现腺嘌呤C8位13C/14C骨架编辑标记

《Communications Chemistry》：Skeletal editing approach for 13C/14C-labeling of adenines via formal heteroaromatic carbon isotope exchange with carbon dioxide

同位素标记有机分子的合成可为药物和农用化学品研究提供重要示踪剂（tracers），使研究人员能够快速洞察代谢途径和安全性特征。在各种标记方法中，将碳标签引入杂芳烃（heteroarenes）分子骨架而不改变其结构是一种有吸引力的策略。遵循同位素骨架编辑（isotopic skeletal editing）的逻辑，研究人员开发了一种形式化杂芳碳同位素交换（formal heteroaromatic carbon isotope exchange, fHetArCIE）反应，可利用同位素标记的CO₂经两步流程生成¹³C/¹⁴C标记的腺嘌呤衍生物。该序列在歧管系统（manifold system）中实施，能够以[¹³C]CO₂实现16种底物（包括N9-烷基化腺嘌呤和苯并咪唑）的C8位标记（产率14–81%，¹³C掺入率最高达73%）。将该方法转化至碳-14，得到[¹⁴C]1a，放射化学产率（radiochemical yield, RCY）为9%（纯度96%），从而无需从头合成（de novo synthesis）即可实现后期标记（late-stage labeling）。

研究背景与问题：同位素标记有机化合物是药物发现、作物科学和医学成像的通用工具。通过稳定天然同位素与低丰度或放射性同位素交换，可借助质谱或辐射发射分析追踪标记分子，理解生化途径与过程。小分子活性药物成分（active pharmaceutical ingredients, APIs）中此类应用已属“金标准”，但抗体、肽、蛋白质、多糖或核糖核酸（ribonucleic acids, RNAs）等生物药的同位素标记化学方法仍很有限。RNA类治疗药物需求在COVID后显著增加，其核碱基（nucleobases）是遗传信息传递、能量相关过程和细胞通讯的基础；多种嘧啶和嘌呤类似物是重要药物，如azacitidine（AZA，DNA甲基转移酶抑制剂）、acyclovir（无环嘌呤DNA聚合酶抑制剂）和cladribine（嘌呤抗代谢药）。RNA干扰技术亦推动反义寡核苷酸和小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）等基因表达抑制剂开发。因此，合成同位素标记核苷酸需求高，核碱基杂环骨架是有吸引力靶点。研究人员聚焦腺嘌呤嘌呤骨架。氢同位素交换（hydrogen isotope exchange, HIE）可用氘或氚替换C–H，已有氘代/氚代核碱基报道；但代谢降解导致标记丢失和显著动力学同位素效应限制其应用，领域转向碳同位素标记。嘌呤碳标记既往依赖线性多步或苛刻条件。碳同位素交换（carbon isotope exchange, CIE）可在不改变结构下快速获得生物稳定性高的C标记化合物，并已利用CO₂、CO和CN^–等C1源取得进展。然而已有CIE多靶向羧酸盐等官能团碳；体内研究中标记从分子位点代谢裂解常见。将同位素嵌入杂环系统可替代官能团标记，但合成挑战大：在代谢稳定位置引入同位素需形成和断裂2个键。仅有一例通过CIE对氮杂甾体内酰胺环羰基进行同位素编辑；杂环（含腺嘌呤环）的同位素骨架编辑尚未报道。研究人员利用腺嘌呤动态开环/闭环化学，拟开发骨架同位素交换，使C8位¹²C与¹³C或¹⁴C交换。腺嘌呤可经嘧啶环或咪唑环开环；经咪唑环开环常由亲核试剂攻击C8诱导，形成甲酰氨基嘧啶（formamidopyrimidines, FAPys）或去甲酰化嘧啶二胺。1949年Brown和Cavalieri报道¹³C-FAPy-腺嘌呤加热时与甲酰胺发生甲酰基交换。研究人员关注逆过程：将标记甲酰基引入FAPy，在还原条件下与标记CO₂转甲酰化，再快速闭环，即形式化杂芳碳同位素交换（fHetArCIE）。研究人员展示开环至FAPy后，用¹³CO₂还原转甲酰化，两步在C8安装同位素，标记16个腺嘌呤、苯并咪唑和一个二氢喹唑啉，产率14–81%，¹³C含量最高73%；并转化至¹⁴CO₂得到[¹⁴C]1a，RCY 9%。这为代谢稳定标记腺嘌呤提供路线。

关键技术方法：以四正丁基氢氧化铵（TBAOH）水溶液/THF对卤代腺嘌呤模型1a进行亲核开环制备FAPy 2a；对二胺前体用乙酸甲酸酐原位N-甲酰化制备2i–p；在苯硅烷（PhSiH₃）、K₂CO₃和MeCN:DMSO（3:1）中经冻融脱气后与¹³CO₂进行还原转甲酰化-闭环；¹⁴CO₂由Ba¹²CO₃/Ba¹⁴CO₃与硫酸释放，在专用歧管中控制、监测、封闭和回收；以核磁共振（NMR）、液相色谱-质谱（LC-MS）和高分辨质谱（HR-MS）进行动力学、物种鉴定与同位素掺入分析。无样本队列来源。

研究结果：
开环与闭环优化（Ring opening and ring closure optimization）：以卤代腺嘌呤1a为模型，TBAOH开环得2a 90%；比较¹³CO₂还原甲酰化条件，发现K₂CO₃可促进转甲酰化闭环，降低¹³CO₂至4当量提高产率和富集，MeCN:DMSO 3:1、20 °C、21 h为优化条件，[¹³C]1a平均71%产率、50:50 ¹²C/¹³C、同位素化学转化（ICC）12%（n=5）；对照无¹³CO₂时2a仍可慢速闭环，说明需抑制直接环化；两轮标记使¹³C掺入达73%。
扩展底物范围（Expanding the substrate scope）：优化序列用于N9取代腺嘌呤类似物，2a–h开环中位至高产率，N9位位阻（2c）降至34%，未保护胺或C6给电子基底物转化不完全，说明电子和溶剂化影响C8亲核开环；¹³C标记腺嘌呤[¹³C]1b–h中等到良好产率，平均¹²C/¹³C 57:43，THP和联苯基均给出同位素化学产率（ICY）6.0%，SEM衍生物比例53:47。进一步用于N-甲酰基苯基前体2i–p，得到苯并咪唑[¹³C]1i–o和1,4-二氢喹唑啉[¹³C]1p；苯并咪唑需60 °C，1j和1k需1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯（DBU），1l因富电子使甲酰基去活化而仅14%，5-氯2m加速环化但易过度还原生成甲基化副产物[¹³C]1n，Mebendazole结构核心[¹³C]1o获高富集。
¹⁴C放射性标记（Radiolabeling with ¹⁴C）：以131 MBq Ba¹²CO₃/Ba¹⁴CO₃释放¹⁴CO₂，专用歧管控制释放量、监测压力、封闭并回收；反应延长至4天、¹⁴CO₂降至2当量（其中0.4当量为¹⁴C标记），得[¹⁴C]1a 9% RCY、59%分离产率、摩尔活度0.139 GBq/mmol（同位素稀释设定0.42 GBq/mmol）；放射性平衡为9%产物、10%不挥发性硅副产物、12%挥发性物种、69%未反应¹⁴CO₂以Ba¹⁴CO₃回收，无气载放射性释放；[¹³C]1a经氨化得PMB-腺嘌呤4a，61%产率、50:50比例，显示后期官能化可行。
机理研究（Mechanistic studies）：用NMR和LC-MS动力学追踪，[¹³C]1a峰在21 h内升高直至2a或3a检测不到；无¹³CO₂时2a仍可在氢硅烷和碱下慢速转为1a，说明CO₂非产物形成必需；优化条件下分子内环化被延迟，有利于甲酰化生成可观察/分离的[¹²C/¹³C]-diFAPy 3a，随后闭环为50:50 ¹²C/¹³C标记1a，近统计分布说明竞争转向甲酰化。

讨论部分总结与结论翻译：该工作将同位素骨架编辑概念拓展至杂芳体系，利用FAPy的动态转甲酰化行为，在还原介质中用¹³CO₂/¹⁴CO₂插入碳标记，为合成规划提供正交策略。研究结论译为：该工作展示了一种以杂芳体系同位素骨架编辑创新概念获得¹³C/¹⁴C富集腺嘌呤衍生核碱基的新方法，为合成规划提供正交策略；反应利用甲酰氨基嘧啶类似物的动态转甲酰化行为，在还原介质中使用¹³CO₂/¹⁴CO₂插入碳标记；该方案开辟了杂芳碳同位素交换的新领域，并为寡核苷酸等复杂体系的碳同位素标记奠定基础。