《Molecular Oncology》：Characterization of therapeutic antibodies targeting lymphatic and vascular resistance factor for the treatment of hypervascularized and highly metastatic cancers
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血管生成（Angiogenesis）是肿瘤进展的主要驱动因素，也是高血管化癌症（如透明细胞肾细胞癌，ccRCC）中经过验证的治疗靶点。然而，抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法的临床获益受到耐药性出现的限制。研究人员鉴定出一种血管内皮生长因子A（V
摘要专业翻译
血管生成（Angiogenesis）是肿瘤进展的主要驱动因素，也是高血管化癌症（如透明细胞肾细胞癌，ccRCC）中经过验证的治疗靶点。然而，抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法的临床获益受到耐药性出现的限制。研究人员鉴定出一种血管内皮生长因子A（VEGFA）剪接变体，命名为淋巴与血管抵抗因子（Lymphatic and Vascular Resistance Factor，LVRF），该因子同时促进血管生成和淋巴管生成，并在抗血管生成治疗后表达上调。为治疗性靶向该通路，研究人员生成了针对LVRF的全人源单克隆抗体。领先抗体显示出高特异性和纳摩尔级亲和力，并有效抑制LVRF驱动的生物学活性。抗LVRF抗体可减少肾癌细胞侵袭、抑制血管和淋巴内皮细胞反应，并抑制淋巴内皮细胞出芽。在体内实验中，治疗显著降低了贝伐珠单抗（bevacizumab）耐药的肾癌异种移植瘤的生长，诱导血管和淋巴管消退，并在斑马鱼模型中减少了转移播散。这些发现将LVRF鉴定为抗血管生成治疗耐药的介导因子，并支持将LVRF靶向治疗作为对当前抗VEGF治疗耐药的血管化肿瘤的新型治疗策略。
论文解读文章
一、研究背景与目的
肿瘤的生长和转移高度依赖新生血管的形成，即血管生成过程。血管内皮生长因子A（VEGFA）是血管生成的核心驱动因子，通过激活VEGFR1/Flt1和VEGFR2/KDR两种酪氨酸激酶受体，促进血管生成并增强血管通透性。在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中，约80%的病例存在Von Hippel–Lindau（VHL）肿瘤抑制基因失活，导致缺氧诱导因子1/2α（HIF1/2α）稳定化并过表达VEGFA，使肿瘤呈现高度血管化特征。
基于此，靶向VEGFA或其受体的抗血管生成疗法成为转移性ccRCC的重要治疗策略。贝伐珠单抗（bevacizumab）作为抗VEGFA单克隆抗体，已被批准用于转移性ccRCC、结直肠癌、非小细胞肺癌等多种癌症的治疗。然而，这类疗法的临床获益受到耐药性出现的严重限制，对总生存期（OS）的改善有限。耐药机制复杂多样，包括VEGFA的复杂剪接调控、溶酶体捕获酪氨酸激酶抑制剂（TKI）、膜结合磷酸酶PTPRk表达下调，以及抗血管生成治疗刺激VEGFC产生从而促进淋巴管生成和转移播散等。
研究人员通过生物信息学分析发现，人VEGFA基因第七内含子中距常规AG剪接受体位点上游21bp处存在一个共识剪接受体位点，该位点的使用导致23bp的插入，产生新的开放阅读框，使VEGFA mRNA的3′非翻译区（3′UTR）区域得以翻译，额外增加64个氨基酸。这一新发现的VEGFA剪接变体被命名为淋巴与血管抵抗因子（LVRF）。初步研究显示，LVRF同时刺激血管生成和淋巴管生成，其表达受贝伐珠单抗选择压力诱导，并在多种肿瘤细胞中高表达。临床数据显示，接受舒尼替尼（sunitinib）治疗的患者血浆中高水平的LVRF与较短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）相关。
基于上述证据，本研究旨在生成针对LVRF的全人源单克隆抗体，验证其抗肿瘤疗效，并明确适用肿瘤类型，为克服抗血管生成治疗耐药提供新的治疗策略。
二、主要技术方法
研究人员采用了多项关键技术方法开展研究。在样本来源方面，使用了来自Champions Oncology的1246例患者来源异种移植瘤（PDX）模型进行RNA-seq分析，以及OriGene Technologies的TissueScan? cDNA阵列（含379例样本、12种癌症类型及正常组织）进行qPCR验证。抗体筛选采用噬菌体展示技术，使用针对LVRF特异性肽段（C-DVTSRGGEPGRRKEPPSGFREPDLS）的人源天然Fab文库进行4–6轮生物淘选，阳性克隆经ELISA验证后重组为人IgG1κ抗体。功能评估方面，采用淋巴内皮细胞（LEC）纤维蛋白珠出芽实验评估抗淋巴管生成活性，采用3D肿瘤球体侵袭实验评估肿瘤细胞侵袭能力。体内实验采用786-O ccRCC细胞皮下异种移植瘤模型评估抗肿瘤疗效，并通过免疫组化（IHC）分析Ki67、CD31和LYVE-1评估肿瘤增殖、血管和淋巴管密度。转移评估采用斑马鱼异种移植模型。
三、研究结果
LVRF在多种实体瘤中广泛表达，并在侵袭性、晚期和转移性疾病中富集
在Cohort 1的1246例PDX模型中，LVRF表达检出率为4.98%（62例），最高频率见于子宫（16.7%）、肾（14.8%）、前列腺（13.3%）、卵巢（12.1%）、胰腺（10.4%）和乳腺（10.1%）肿瘤。病理特征分析显示，62例LVRF阳性肿瘤中74%为低分化、71%为III–IV期、58%来源于转移灶。Cohort 2的qPCR验证显示，约50%正常组织和约70%肿瘤样本中检出LVRF表达，肿瘤相对于匹配正常组织显著上调，前列腺癌上调21倍、乳腺癌和卵巢癌上调4倍、肺癌和肾癌上调2倍。
LVRF表达受缺氧诱导并在TKI治疗中上调
使用786-O肾癌细胞，研究人员证明缺氧（1% O?）可诱导LVRF mRNA表达，缺氧与血清饥饿联合具有协同效应。氯化钴（CoCl?）在常氧条件下稳定HIF2α可重现此效应。舒尼替尼或阿昔替尼（axitinib）急性处理786-O细胞48小时分别使LVRF mRNA上调5.2倍和6.6倍，获得性耐药细胞系中LVRF表达分别持续升高2.9倍和1.8倍。体内实验中，阿昔替尼治疗40天后，肿瘤组织LVRF mRNA水平较对照组升高3.4倍。
通过噬菌体展示筛选生成并表征抗LVRF抗体
经生物淘选获得96个阳性克隆，其中16个独特序列结合肽段，12个同时识别全长LVRF蛋白。重组人IgG1抗体中，P1B7、P2H3、P1F12和P1C9四个克隆对人和鼠全长LVRF及LVRF/NF肽段均表现出最强反应性。四个抗体对人和鼠LVRF的解离常数（KD）均达亚纳摩尔级别（0.009–0.028 nM），且特异性识别LVRF的NF结构域肽段而不结合VEGFA，贝伐珠单抗则无法识别LVRF特异性NF结构域。
抗LVRF抗体体外抑制淋巴管生成并降低肿瘤球体侵袭性和活力
在LEC纤维蛋白珠出芽实验中，重组LVRF显著增加出芽形成珠数，而P2H3、P1B7和P1C9抗体处理可将其恢复至接近基础水平。在786-O细胞3D球体侵袭实验中，抗LVRF抗体剂量依赖性降低肿瘤细胞侵袭面积，并伴随细胞代谢活性（CellTiter-Glo）的降低。
抗LVRF抗体在贝伐珠单抗耐药ccRCC模型中抑制肿瘤生长并损害肿瘤血管化
在786-O异种移植瘤模型中，三种抗LVRF抗体（7.5 mg/kg腹腔注射，每周两次，40天）均显著抑制肿瘤生长。P2H3实现43%完全消退，肿瘤生长抑制率（TGI）为58%；P1B7实现57%完全消退，TGI为58%；P1F12实现43%完全消退，TGI最高达64%。免疫组化分析显示，抗LVRF抗体不影响Ki67阳性细胞数和肿瘤增殖指数，但显著降低CD31阳性通畅血管密度并增加塌陷血管比例，同时显著降低LYVE-1阳性淋巴管密度，治疗组中超过70%的残留淋巴管呈塌陷形态，而对照组不足20%。
领先抗LVRF抗体P2H3在斑马鱼异种移植模型中减少远处转移
在斑马鱼异种移植转移模型中，P2H3抗体处理使远处转移灶数量显著减少60%（P<0.0001，Mann–Whitney检验，汇总三次独立实验）。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，仅靶向VEGFA及其受体的策略过于简化，忽视了肿瘤细胞、免疫细胞等也表达VEGFA受体的复杂性。LVRF作为新发现的VEGFA剪接变体，兼具促血管生成和促淋巴管生成特性，其表达受抗血管生成治疗压力诱导，是耐药的重要介导因子。研究人员提出抗LVRF治疗可与现有疗法组合，包括与卡博替尼（cabozantinib）或仑伐替尼（lenvatinib）等多靶点RTKi联合以协同增效并延缓耐药，与免疫检查点抑制剂（ICI）联合以通过血管正常化改善免疫细胞浸润，以及与HIF-2α抑制剂贝祖替凡（belzutifan）联合以同时阻断HIF依赖和非HIF依赖的耐药机制。患者选择方面，建议采用生物标志物驱动策略，结合组织LVRF表达检测（IHC、RNA原位杂交、RT-qPCR）和循环LVRF水平监测，实现动态评估耐药出现并指导治疗时机。领先抗体P2H3的选定基于综合评估，包括稳定性、药代动力学特征和低免疫原性风险等可开发性标准。研究局限性包括免疫缺陷小鼠和斑马鱼模型无法完全模拟人肿瘤微环境的免疫互作，以及LVRF表达异质性对患者分层的要求。
研究结论部分指出，本研究将LVRF鉴定为VEGFA剪接变体，是肾细胞癌中血管生成、淋巴管生成和抗血管生成治疗耐药的关键驱动因子。研究证明全人源抗LVRF抗体能有效阻断肿瘤血管化、侵袭和转移，包括在贝伐珠单抗耐药模型中。这些发现确立了LVRF作为临床相关治疗靶点的地位，并支持抗LVRF抗体作为克服当前抗VEGFA治疗耐药的有前景策略。
