血浆蛋白质组学特征预测新发肌萎缩侧索硬化：基于C9orf72扩增分层的前瞻性研究

《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Plasma Proteomic Signatures Predict Incident Amyotrophic Lateral Sclerosis: A Prospective Study Stratified by C9orf72 Expansion

　　

背景：肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种进行性且致命的神经系统疾病，目前缺乏可靠的临床前生物标志物来预测疾病发病。血浆蛋白质组学为早期检测提供了有前景的途径。识别与新发ALS相关的血浆蛋白和通路，有望改善早期诊断、实现风险分层并揭示疾病机制。方法：研究人员采用Olink Explore平台，在英国生物银行（UK Biobank）参与者的前瞻性队列中定量2920种血浆蛋白。采用多变量Cox比例风险回归识别与新发全身性ALS、C9_orf72相关ALS（C9-ALS）和非C9_orf72相关ALS（non-C9-ALS）相关的蛋白。进行富集分析以描绘所识别蛋白涉及的生物学通路。通过线性回归评估血浆蛋白水平与ALS起病年龄（AAO）的关联，采用多变量Cox模型评估蛋白水平与ALS生存的关系。随后使用孟德尔随机化（MR）和共定位评估潜在因果关系，并分析ALS中蛋白的横断面时间模式。结果：在这项前瞻性队列研究中，研究人员随访了52 584名UK Biobank参与者，平均11.8年。期间识别291例（0.55%）新发ALS病例，其中34人携带C9_orf72六核苷酸重复扩增（HRE）突变。九种蛋白与全类型ALS风险相关（FDR<0.05）：NEFL（HR: 2.897）、CSRP3（HR: 1.233）、MYBPC1（HR: 1.352）、MEGF10（HR: 1.744）、MYOM3（HR: 1.289）和THBS4（HR: 1.570）为危险因素，而EGFLAM（HR: 0.402）、ITGAV（HR: 0.284）和CD248（HR: 0.573）显示保护效应。NEFL（HR: 2.742）和另外三种蛋白主要与non-C9-ALS相关，而仅NEFL（HR: 4.403）和COL5A1（HR: 3.072）与C9-ALS显示显著关联。与年龄和性别联合时，这些蛋白在预测3、5和10年ALS的曲线下面积（AUC）值超过0.750。此外，NEFL水平升高与non-C9-ALS较早起病相关，并在诊断前约9.27年开始升高，在non-C9-ALS病例中于临床表现前1–2年达到峰值（通过横断面时间分析）。通路分析涉及肌肉相关、细胞外基质、能量代谢和炎症通路。结论：该研究揭示了与ALS风险相关的广泛血浆蛋白改变，发现散发性及C9_orf72相关ALS的潜在新型生物标志物。这些结果增强了对早期ALS发病机制的理解，并为后续生物标志物识别和靶向治疗策略开发奠定基础。

研究背景：肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种致命且异质性强的中枢神经系统神经退行性疾病，早期诊断困难、预后不佳，症状出现后中位生存期约3–5年。ALS神经退行性变在临床表现出现前很久即已开始，当肢体无力、吞咽困难、构音障碍或呼吸受损等症状明显时，已有相当比例运动神经元退化。其发病机制涉及遗传易感与环境因素相互作用，C9_orf72六核苷酸重复扩增（HRE）是欧洲血统ALS人群最常见的遗传病因。既有血浆、脑、脑脊液和肌肉蛋白质组研究虽发现若干ALS相关蛋白，但多聚焦症状期患者，难以揭示无症状期蛋白质组特征；既往研究多为横断面设计，易受反向因果影响，样本量有限，且部分研究未充分控制遗传背景；C9_orf72 HRE不完全外显也提示其他蛋白和通路可能修饰从携带状态向症状性疾病进展。UK Biobank血浆蛋白质组资源为研究ALS发病前十年蛋白质组改变提供机会。研究人员基于52 584名参与者的前瞻性分析，评估基线2920种血浆蛋白与新发ALS的关联，并按C9_orf72 HRE状态分层，构建疾病预测模型，分析蛋白与起病年龄（AAO）及生存的关系，并研究横断面时间模式、孟德尔随机化（MR）和共定位及功能富集，以探索潜在致病机制。该研究结论具有重要意义：发现与新发ALS及C9-ALS亚型相关的既往未识别预测蛋白，为早期诊断、风险分层、生物标志物识别和靶向治疗策略提供依据。

关键技术方法：研究基于UK Biobank前瞻性队列，从53 014名有蛋白质组数据者中排除基线ALS或额颞叶痴呆、协变量缺失、撤回研究及无全基因组测序（WGS）数据者，最终纳入52 584人。采用Olink平台检测2923种蛋白，剔除缺失率>50%的3种蛋白后分析2920种。利用WGS和ExpansionHunter识别C9_orf72 HRE>30次重复携带者。主要终点为新发ALS，随访至诊断、死亡、失访或2023年9月。统计采用Cox比例风险模型、线性回归、Kaplan–Meier分析、时间依赖受试者工作特征曲线及曲线下面积（AUC）、协方差分析、广义相加模型（GAM）、富集分析、MR和共定位；显著性采用错误发现率（FDR）校正。

研究结果：
3.1 人群特征：通过描述性统计和组间比较，纳入52 584名基线无ALS且有蛋白质组数据者，平均年龄56.8岁（SD 8.2），女性53.9%，White 93.3%；平均随访11.8年，记录291例新发ALS，其中34例携带C9_orf72 HRE>30次重复；内部验证队列26 292人，随访期间136例新发ALS。
3.2 蛋白质与全类型新发ALS风险关联：采用多变量Cox比例风险模型并调整年龄、性别、族裔、Townsend剥夺指数、体质指数、吸烟、饮酒频率、空腹时间和样本年龄，2920种蛋白中9种与ALS风险显著相关（FDR<0.05）。NEFL关联最强（HR: 2.897，95% CI: 2.566–3.271），EGFLAM（HR: 0.402）、ITGAV（HR: 0.284）、CD248（HR: 0.573）为保护效应，CSRP3、MYBPC1、MEGF10、MYOM3、THBS4为危险因素。九种蛋白联合年龄和性别预测3、5、10年ALS的AUC均>0.78，3年最高（AUC: 0.867，95% CI: 0.826–0.924）；内部验证中NEFL、CD248、EGFLAM、ITGAV和MYBPC1仍显著，模型优于仅年龄和性别模型。
3.3 蛋白质与非C9-ALS风险关联：排除C9_orf72突变携带者后，Cox模型显示4种蛋白与non-C9-ALS风险显著相关：NEFL（HR: 2.742，95% CI: 2.392–3.143）、MYBPC1（HR: 1.395）、MYOM3（HR: 1.323）、CSRP3（HR: 1.239）；NEFL和MYBPC1在内部验证中仍显著。四蛋白联合年龄和性别预测3年AUC为0.808，所有时间点AUC>0.78，优于年龄和性别基线模型。
3.4 蛋白质与C9-ALS风险关联：比较C9-ALS患者与健康对照的Cox模型显示，NEFL（HR=4.043，95% CI: 3.069–5.327）和COL5A1（HR=3.072，95% CI: 2.124–4.444）与C9-ALS发病显著相关，并在内部验证中验证。NEFL、COL5A1联合年龄和性别预测C9-ALS的3年AUC为0.955（95% CI: 0.902–1.000），所有评估时间点AUC>0.77，优于仅年龄和性别模型。
3.5 C9_orf72 HRE携带者中蛋白质与C9-ALS风险关联：对128名C9_orf72 HRE携带者分析显示，ALS患者中位扩增次数高于非ALS对照（p=0.012），但30–100次重复者可发病，数千次重复者亦可未发病；HRE大小与ALS起病年龄无显著关联。在携带者中应用Cox模型，FDR校正后仅NEFL与ALS风险显著相关（HR=3.378，95% CI: 1.954–5.839），随后发生ALS者基线NEFL水平显著更高；HRE大小与血浆NEFL水平无显著线性相关（校正p=0.080）。
3.6 蛋白质与ALS起病年龄关联：全类型ALS平均AAO为65.967岁（SD 7.797），non-C9-ALS为66.422岁（SD 7.940），C9-ALS为62.534岁（SD 5.608）；未调整分析提示C9-ALS起病较早，但调整混杂因素后差异不显著。线性回归调整协变量后，较高NEFL水平与全类型ALS（β=?1.501，FDR<0.001）和non-C9-ALS（β=?1.440，FDR<0.001）较早AAO相关，C9-ALS中无显著关联（β=?1.159，FDR=0.467）；SSC5D显示潜在关联（β=2.691），但FDR=0.178。
3.7 蛋白质与ALS生存关联：全类型ALS平均生存2.518年（SD 2.852），non-C9-ALS为2.637年（SD 2.968），C9-ALS为1.624年（SD 1.479）。Kaplan–Meier分析显示C9-ALS总体生存显著短于non-C9-ALS（log-rank p=0.048）。Cox模型经FDR校正后，全类型和non-C9-ALS中诊断前血浆蛋白与生存无显著关联；C9-ALS中鉴定33种候选蛋白，但样本量有限且Schoenfeld检验提示多个协变量可能违反比例风险假设，需谨慎解释。
3.8 ALS相关蛋白的横断面时间模式：以平均绝对Z-score≥0.20定义，14种蛋白在诊断前异常；NEFL、MYOM3、MEGF10、CSRP3、MYBPC1、THBS4、ITGAV、CD248和EGFLAM等显示显著改变，CAPN3、MCEE、HS6ST2、SHBG和VSIG10虽未在时变分析中显著，但临床前已失调。扩展纳入基线前诊断ALS者45例后，GAM显示NEFL约诊断前9.27年开始升高，non-C9-ALS于诊断前1–2年达峰；C9-ALS无明确诊断前峰值，但NEFL上升速率更明显。协方差分析发现5种差异蛋白，Cox候选风险蛋白在该比较中未显著。
3.9 ALS相关蛋白的生物学功能：对名义p<0.05蛋白进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，发现肌肉相关通路、细胞外基质、能量代谢和炎症通路富集；non-C9-ALS富集谱与全类型ALS相近；C9-ALS富集结果略有不同，但三组共同KEGG通路包括细胞黏附分子和PPAR信号通路；C9_orf72 HRE携带者从非ALS向ALS转变相关通路中，免疫受体和细胞因子受体相互作用最突出。
3.10 MR和共定位评估因果血浆蛋白靶点：以蛋白质数量性状位点（pQTL）为工具变量，对Cox分析显著的10种蛋白进行MR，共选取202个单核苷酸多态性作为有效工具变量。遗传预测的MYOM3水平升高与ALS风险名义增加相关（OR: 1.101，95% CI: 1.003–1.210，p=0.043）；敏感性分析评估异质性和多效性；共定位分析未发现蛋白pQTL与ALS全基因组关联信号共享因果变异的显著证据（所有PPH4<0.8）。
3.11 敏感性分析：主要关联在年龄和性别亚组中大体一致；EGFLAM、ITGAV和THBS4在<60岁亚组中关联更强；采用1年、3年和5年滞后期的敏感性分析结果相对一致；NEFL和MEGF10存在轻度时变效应，但全随访HR与0–3年、0–5年和0–10年期间HR的方向和幅度大体一致。

讨论部分总结：研究支持NEFL作为ALS预测生物标志物，其预测能力可早至临床前约十年，且不限于既往报道的12个月窗口，亦不受C9_orf72 HRE状态影响；non-C9-ALS中NEFL于诊断前1–2年达峰，可能受缺乏同一个体重复纵向测量影响，C9-ALS则表现为无诊断前峰值但上升更快。调整混杂后，较高诊断前NEFL水平独立预测non-C9-ALS较早AAO，但诊断前NEFL与生存无显著相关；C9-ALS中若干诊断前蛋白与生存相关，但样本量小，应谨慎解释。研究还验证CSRP3、MYBPC1、MYOM3和MEGF10等既往横断面研究报告的蛋白，并提出EGFLAM、ITGAV、THBS4和CD248等新候选蛋白；这些循环蛋白签名不能确证原发性肌肉病理或恶病质，蛋白可能来源于神经、肝脏或炎症来源，也不能排除肌肉病理生理改变参与ALS发病。C9-ALS方面，除NEFL外，COL5A1可能影响C9-ALS风险；C9_orf72 HRE不完全外显且重复长度与疾病风险无严格线性关系，提示其他遗传和环境因素修饰发病可能性和时间。MR提示MYOM3潜在因果作用，但缺乏共定位支持，不能排除水平多效性。预测模型可在临床前多年预测ALS，具有早期干预试验和个体化监测意义，但校准存在保守偏倚。优势包括大样本、前瞻性和长期随访，Olink邻近延伸分析（PEA）具备低样本需求、高灵敏度、双抗体特异性、NPX标准化及多组学兼容性；局限包括Olink靶向设计、仅基线蛋白质组测量、UKB-PPP非随机分层可能引入选择偏倚、缺乏独立外部队列验证、少数non-C9 HRE ALS致病变异、注册诊断残留误分类、女性对照较多及93% White队列限制外推。结论翻译：研究人员发现了与新发ALS及C9-ALS亚型相关的既往未识别预测蛋白。参与这些新识别病理过程的蛋白——包括EGFLAM、ITGAV、THBS4和CD248——可能作为可靠预测指标和有前景的治疗靶点。此外，COL5A1相较于一般ALS人群优先与C9-ALS相关，提示潜在亚型特异性病理相关性。这些发现有助于弥补关于早期ALS发病机制的关键知识空白，并强调其在指导早期生物标志物识别和靶向治疗策略设计中的效用。