PRDM16在三叉神经节感觉神经元发育与分化中的必需作用：斑马鱼与小鼠的跨物种证据

《Developmental Dynamics》：PRDM16 is necessary for sensory neuronal development and differentiation in the trigeminal ganglion

　　

背景：颅神经嵴细胞（cranial neural crest cells，cNCC）可产生颅面部软骨、骨以及外周神经元和胶质；当软骨/神经元/胶质祖细胞分化失败时，可导致出生缺陷。PRDM16是一种含锌指和SET结构域的转录调节因子，已被认为与颅面发育和口面裂相关，但其在颅感觉神经节形成中的作用尚未明确。

结果：本研究中，研究人员证明prdm16是三叉神经节（trigeminal ganglion，TG）组装以及来源于颅神经嵴谱系的感觉神经发生所必需。在斑马鱼中，prdm16在TG和sox10⁺神经嵴细胞中高表达，始于受精后18小时（hours post fertilization，hpf），并持续至48 hpf的较晚发育阶段。类似地，小鼠TG神经元在胚胎第18.5天（embryonic day 18.5，E18.5）也可见Prdm16表达。在prdm16功能缺失斑马鱼中，24 hpf和48 hpf时HuC⁺ TG神经元减少，导致整体神经节体积和面积降低。Tg(sox10:mRFP; elavl3:GFP)胚胎活体成像显示，野生型和突变体中迁移至TG区域的sox10⁺ cNCC数量相似；然而，prdm16^?/?中可观察到三叉神经节细胞数量和面积减少。乙酰化β-微管蛋白（acetylated β-tubulin）免疫染色显示，早期三叉神经轴突投射减少，至48 hpf时投射模式发生改变。p2rx3b⁺限定感觉神经元群体在prdm16^?/? TG中信号强度降低且细胞数减少。对荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）分离的sox10⁺颅神经嵴细胞进行转录组分析，显示关键神经发生和感觉谱系基因表达降低。最后，PRDM16在三叉神经发生中的作用在脊椎动物中保守：与对照相比，Prdm16^csp1/csp1突变小鼠胚胎在E18.5也表现出TG内侧外侧直径、整体面积减小以及HuC⁺神经元减少。

结论：这些数据共同确定Prdm16是三叉神经节生长和感觉神经元分化的保守调节因子，将PRDM家族染色质调节因子与外周感觉神经系统发育联系起来。

研究背景与问题：颅神经嵴细胞（cNCC）经历诱导、迁移和分化，形成颅面部骨、软骨、外周神经元和胶质等衍生物；其分化受基因调控网络（gene regulatory networks，GRN）和染色质修饰因子的精密控制。三叉神经节（TG）是最大且最早形成的颅感觉神经节，由cNCC与颅基板细胞相互作用组装，其感觉神经元传递面部触觉、痛觉、温度和本体感觉等信息。尽管PRDM16已被发现参与颅面发育、口面裂及小鼠腭裂等表型，且PRDM家族成员可作为组织特异性转录因子和染色质调节因子发挥作用，但PRDM16在cNCC向TG神经元分化、TG生长及三叉神经轴突投射中的作用尚未明确。因此，研究人员以斑马鱼和小鼠为模型，检验prdm16在TG形成、感觉神经发生和轴突导向中的必要性，并分析其对cNCC神经发生转录程序的影响。研究结论表明，Prdm16是TG生长、感觉神经元分化及三叉神经布线成熟的保守调节因子，将PRDM家族染色质调节因子与外周感觉神经系统发育联系起来，对理解颅感觉神经节发育及相关颅面/感觉障碍具有意义。

方法概括（不超过250字）：研究使用斑马鱼AB野生型、prdm16^CO1027突变体（CRISPR/Cas9产生，PR/SET结构域上游移码）及Tg(sox10:mRFP)、Tg(elavl3:eGFP)、Tg(sox10:eGFP)、Tg(six1b:lynGFP)等转基因系；小鼠Prdm16^csp1系来自The Jackson Laboratory，FVB/NJ背景，取E18.5同窝匹配胚胎。采用全胚杂交链式反应（hybridization chain reaction，HCR）原位杂交、活体共聚焦时间序列成像（约22–34 hpf）、全胚免疫荧光与小鼠矢状切片免疫组化、IMARIS三维定量，以及FACS分离sox10:EGFP⁺颅神经嵴细胞后的RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq；GEO：GSE175767）；统计采用Kruskal–Wallis非参数检验。

研究结果：
2.1 prdm16在神经嵴向三叉神经节神经元分化过程中表达：研究人员通过HCR、转基因报告和免疫荧光发现，14 hpf时prdm16未在发育中TG邻近区域明显表达，18 hpf起出现在TG邻近区域，24 hpf清晰可检测，并持续至48 hpf，主要在elavl3表达腹侧域；prdm16与sox10⁺神经嵴细胞及six1b⁺基板区域存在空间关联，且sox10⁺ cNCC与多个颅感觉神经节HuC⁺神经元高度重叠，提示其表达时空模式适合影响TG形态发生和神经嵴来源细胞分化。
2.2 prdm16突变体三叉神经节神经元细胞数和体积持续减少：通过prdm16^?/?斑马鱼中HuC免疫染色和IMARIS三维定量，研究人员发现24 hpf时TG内HuC⁺神经元显著减少；48 hpf时该神经元缺陷持续存在，TG体积显著降低、表面积中度降低，而sox10:RFP⁺细胞仍存在于TG区域，说明突变体整体神经节变小并伴神经元丢失。
2.3 尽管prdm16突变体神经节变小，迁移至TG的神经嵴细胞数量相似：利用Tg(sox10:mRFP; elavl3:GFP)活体成像追踪22–34 hpf，研究人员发现sox10⁺ cNCC迁移路径及TG区域细胞数与野生型相似，但突变体TG面积持续减小；24 hpf时TG及TG邻近区域的pHH3（phospho-histone H3，增殖标记）和cleaved Caspase-3（细胞死亡标记）无显著差异，提示表型并非源于神经嵴迁移、增殖或凋亡改变，而更可能为分化/成熟缺陷。
2.4 prdm16缺失减少三叉神经轴突投射数量并改变投射形态：通过乙酰化β-微管蛋白免疫染色，研究人员在24 hpf发现突变体TG相关轴突投射数显著减少，部分分支缺失或缩短，靠近TG的纤维增粗；48 hpf时野生型呈密集细分支网络，而突变体细分支减少并出现TG周围异常纤维聚集，说明prdm16为正常三叉神经分支模式和支配所必需。
2.5 prdm16是TG中p2rx3b型感觉神经元分化所必需：p2rx3b编码P2X3嘌呤能受体亚基，为细胞外ATP门控阳离子通道，与初级感觉神经元和伤害感受信号相关。通过p2rx3b HCR与sox10:RFP联合分析，研究人员发现48 hpf时prdm16^?/? TG中p2rx3b⁺感觉神经元数量显著减少，TG内p2rx3b平均信号强度亦显著降低，提示该伤害感受器相关感觉神经元亚群分化受损。
2.6 prdm16是维持sox10⁺颅神经嵴细胞适当神经发生转录程序所必需：研究人员重新分析48 hpf FACS分离sox10:EGFP⁺ cNCC的RNA-seq数据，发现prdm16^?/?中neurog1、neurod6a/b、neurod4等核心神经发生转录因子及ntrk2a/2b、ntrk3a/3b等感觉谱系相关基因下调；HCR验证显示neurog1和neurod1在颅感觉神经节及咽弓区域表达降低，支持prdm16维持cNCC神经发生程序。
2.7 小鼠Prdm16缺失导致TG大小和神经元细胞数减少：研究人员在E18.5小鼠左TG连续10 μm矢状切片中联合HuC、FABP7、神经丝和DAPI分析，发现PRDM16与HuC⁺神经元区域重叠；Prdm16^csp1/csp1胚胎TG横截面积、内外侧跨度和HuC⁺神经元数较对照显著减少，说明PRDM16在TG发育中的作用在小鼠中保守。

讨论与结论总结：讨论指出，prdm16在TG发育的精确时空窗口表达，功能上促进TG神经元分化并控制下游神经元基因，支持其激活cNCC衍生物神经元及软骨GRN的模型；TG具有cNCC与基板双起源，prdm16可能参与协调二者组装，但原文未排除其在神经嵴和颅基板中的双重需求。突变体表型并非由神经嵴迁移、增殖或死亡改变所致，而更符合迁移后分化缺陷；轴突投射减少和分支结构异常进一步支持分化/成熟受损。prdm16与其旁系同源基因prdm1a、prdm3在细胞命运决定和分化中具有背景依赖性作用，prdm16在颅面发育中呈激活作用，与本研究促进TG神经元命运和分化的结果一致。机制上，prdm16支持感觉神经发生程序和亚型分化，p2rx3b⁺感觉神经元减少及sox10⁺ cNCC中Neurog/Neurod家族和trk受体等基因下调支持这一模型。小鼠Prdm16^csp1模型虽存在严重腭裂等晚期颅面缺陷，可能与TG表型存在二次影响，但斑马鱼与小鼠一致的结果支持Prdm16对TG发育的直接、保守需求。研究结论（译）：这些数据确定Prdm16是促进三叉神经节生长、感觉神经发生及三叉神经布线成熟的外周感觉神经系统发育转录调节因子。