细胞衰老在特发性肺纤维化中扰乱抗病毒干扰素应答

《Aging Cell》：Cellular Senescence Dysregulates Antiviral Interferon Responses in Idiopathic Pulmonary Fibrosis

　　

特发性肺纤维化（IPF）患者对呼吸道病毒感染高度易感，但将纤维化重塑与局部抗病毒防御功能受损联系起来的细胞机制仍不清楚。本研究探讨了细胞衰老如何塑造来自健康（HLF）和IPF患者的原代肺成纤维细胞对甲型流感病毒（IAV）感染的应答。转录组学分析确定感染是DNA损伤诱导的衰老HLF和IPF成纤维细胞中基因表达的主要驱动因素，并揭示了两种细胞状态下经典抗病毒通路的诱导。然而，衰老的IPF成纤维细胞呈现出一种独特的抗病毒应答状态，其特征是更广泛的独特诱导基因集合以及抗病毒转录网络差异性的协调。功能上，衰老增加了HLF和IPF成纤维细胞中的病毒滴度，而衰老的IPF成纤维细胞表现出改变的炎症应答。网络分析将病毒应答和细胞周期相关模块特异性地与衰老HLF感染状态相关联，而这些程序在衰老IPF成纤维细胞中较弱。转录因子推断确定了IRF3和STAT1是衰老HLF和IPF成纤维细胞中这种改变的抗病毒状态的可能调控因子。与网络和转录因子分析一致，siRNA介导的IRF3或STAT1耗竭显著降低了衰老HLF成纤维细胞中IFN-β的分泌，而IPF成纤维细胞仅表现出较温和的效应，表明这些通路在抗病毒控制中具有疾病特异性的依赖性。总之，这些发现表明，细胞衰老与纤维化成纤维细胞特性的结合形成了一种功能失调的抗病毒状态，这可能有助于解释IPF患者对病毒相关急性加重和疾病恶化的高易感性。

论文解读文章

研究背景与科学问题

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、不可逆的间质性肺病，日益被视为一种与年龄相关的肺部疾病。在当前的IPF发病机制模型中，衰老不再仅仅被视为人口统计学背景，而是疾病的机制性驱动因素。在衰老的标志中，细胞衰老已成为直接导致异常组织重塑的关键过程。实验证据支持衰老细胞在纤维化肺病中的因果作用，因为其积累在纤维化组织中可检测到，且清除衰老细胞可在体内减轻肺纤维化。

呼吸道感染在IPF中具有重要的临床意义，不仅作为疾病进展的辅助因素，还可能作为急性加重（该病最具破坏性的并发症）的潜在触发因素。IPF急性加重与极差的短期预后相关，尽管采取治疗干预，报告死亡率常超过50%。这种临床脆弱性提示局部宿主防御受损是纤维化肺病的一个相关组成部分。

在呼吸道病原体中，甲型流感病毒（IAV）是全球病毒性下呼吸道感染的主要原因，因此为探究纤维化肺中的抗病毒防御提供了临床和生物学相关的模型。尽管上皮损伤仍是纤维化概念的核心，成纤维细胞日益被视为具有免疫能力的结构细胞，能够感知危险信号、响应炎症信号并主动塑造局部固有防御程序。在IPF涉及的基质 compartments 中，成纤维细胞占据核心位置，因为它们既是细胞外基质沉积的主要效应细胞，也是组织重塑的主动调控因子。从IPF肺中分离的多种成纤维细胞亚型表现出衰老相关表型，包括改变的生存程序、凋亡抵抗、线粒体功能障碍、端粒异常以及获得衰老相关分泌表型（SASP），所有这些被认为在病变肺内强化促纤维化信号。

然而，尽管在将成纤维细胞衰老定义为基质重塑驱动因素方面取得了实质性进展，但关于衰老如何塑造肺成纤维细胞对病毒感染发起内在应答的能力知之甚少。这一问题的背景是：对IAV的细胞内在防御依赖于对病毒RNA的快速感知和以干扰素为中心的转录程序的激活。在肺细胞中，RNA传感器RIG-I依赖性信号传导和干扰素调节因子3（IRF3）的激活对I型干扰素的诱导至关重要，而下游转录因子如信号转导与转录激活因子1（STAT1）则协调抗病毒干扰素刺激基因（ISG）应答。然而，衰老与受损或失调的抗病毒干扰素应答相关，包括RIG-I相关信号传导的缺陷，这提出了年龄相关细胞状态可能将病毒感知与有效效应功能解偶联的可能性。

研究人员假设，感染后衰老的IPF肺成纤维细胞会采用一种放大的、促炎的状态，这与IPF中恶化的组织病理和修复相关。解决这一问题可能提供机制性见解，解释为何衰老的纤维化肺特别容易受到感染相关的恶化和急性加重的影响。因此，研究调查了纤维化成纤维细胞中的衰老是放大抗病毒信号传导，还是驱动一种不同的宿主应答状态，在该状态中病毒感知、干扰素输出和感染的功能控制变得解偶联。

研究设计与主要技术方法

研究人员使用来自3位健康供体（HLF）和4位IPF供体的原代人肺成纤维细胞，通过15戈瑞γ照射（IR）诱导衰老，并在照射后10天以MOI为1进行IAV感染24小时。研究采用批量RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，使用DESeq2进行差异表达分析，通过基因本体（GO）富集和基因集富集分析（GSEA）进行功能注释，使用decoupleR结合CollecTRI数据库进行转录因子（TF）活性推断，使用加权基因相关网络分析（WGCNA）构建基因共表达网络，并通过空斑实验、多重细胞因子检测、siRNA敲低和qRT-PCR进行功能验证。

研究结果

2.1 衰老的健康和IPF肺成纤维细胞暴露于感染后激活经典病毒应答通路，但个体基因水平存在异质性

在诱导衰老和感染前，静息IPF肺成纤维细胞相对HLF表现出病毒相关通路（包括干扰素应答信号、病毒过程负调控和病毒基因组复制）的抑制，以及IRF1、STAT1和STAT3等病毒相关转录因子的预测抑制。感染后，主成分分析显示感染是基因表达变化的主要驱动因素。衰老IPF成纤维细胞在感染后表现出比衰老HLF更多的上调基因，有176个独特的显著上调基因。共享的上调差异表达基因（DEGs）包括IFNβ1。基因本体富集和GSEA显示两种细胞状态的病毒应答通路高度相似，但代谢相关通路（如线粒体翻译、呼吸电子传递和氧化磷酸化）在HLF和IPF之间存在独特差异。在个体基因水平，OAS1、OAS2、MX1、RSAD2和CXCL10等抗病毒效应基因仅在衰老IPF感染条件下显著上调。

2.2 IPF成纤维细胞中的衰老导致病毒滴度降低和细胞因子产生改变

功能实验显示，与各自静息对照相比，衰老HLF和IPF成纤维细胞均表现出增加的病毒滴度。然而，衰老IPF成纤维细胞在感染后24小时的病毒滴度显著低于衰老HLF成纤维细胞。多重细胞因子检测显示，感染的静息和衰老IPF成纤维细胞中促炎细胞因子产生总体减少，其中IP-10（CXCL10）在静息和衰老IPF成纤维细胞中均显著降低。这表明IPF成纤维细胞中衰老诱导导致对病毒感染的反应发生转变，特征是病毒复制减少和细胞因子分泌降低。

2.3 衰老健康肺成纤维细胞基因表达特征与病毒应答和细胞周期相关

WGCNA分析揭示了两个与衰老HLF感染状态显著相关但未与衰老IPF感染状态显著相关的模块：Black模块富集病毒应答相关基因，Brown模块富集细胞周期相关基因。Black模块中的个体基因如RIGI（检测感染细胞内病毒RNA，已知在多种衰老背景中受损）代表了驱动衰老HLF感染细胞状态的潜在靶点。这表明衰老HLF成纤维细胞具有更强的病毒应答协调连接，而衰老IPF成纤维细胞尽管上调更多病毒应答基因，却未能形成协调的功能应答。

2.4 转录因子推断识别衰老健康和IPF肺成纤维细胞中差异的IRF3/STAT1相关抗病毒程序

转录因子富集分析显示，感染后衰老HLF和IPF成纤维细胞中病毒相关转录因子总体相似，但衰老IPF成纤维细胞中STAT1和IRF3的推断激活水平高于HLF，两者活性评分均增加约5。将单个基因映射到各TF相关特征显示推断的TF活性与两种条件下的基因表达模式高度一致。这表明两种细胞状态在感染后参与相似的抗病毒TF库，但在关键干扰素相关调控因子（特别是IRF3和STAT1）的相对激活上存在差异。

2.5 IRF3和STAT1是衰老健康成纤维细胞抗病毒控制所必需的

通过siRNA敲低实验，IRF3敲低后衰老HLF成纤维细胞在感染后24小时的病毒空斑形成未见增加，且IRF3或STAT1的耗竭均显著降低了衰老HLF成纤维细胞感染后的IFN-β分泌。相比之下，衰老IPF成纤维细胞在敲低IRF3或STAT1后仅表现出较温和的变化，表明衰老HLF成纤维细胞的抗病毒应答比衰老IPF成纤维细胞的相应应答更强烈地依赖这些信号节点。衰老标志物表达分析显示，IRF3敲低后衰老HLF中CDKN1A增加和LMNB1降低，而衰老IPF中仅在非靶向条件下观察到LMNB1显著下调。ISG表达分析显示MX1和OAS1在感染后衰老IPF中上调，但ISG上调总体独立于IRF3和STAT1敲低。这些发现提供了对转录因子推断的功能验证，确定IRF3/STAT1是衰老HLF肺成纤维细胞抗病毒防御的关键效应因子，而这些因子在IPF肺成纤维细胞中未被功能激活。

讨论与结论

研究结果与初始假设相反：细胞衰老并未简单强化已有的纤维化程序，而是衰老IPF肺成纤维细胞呈现一种独特的基质抗病毒功能障碍状态，其中经典感知通路保持可诱导，但其下游执行在功能上被禁用。关键观察是抗病毒转录程序的激活并不等同于有效的抗病毒防御。衰老IPF成纤维细胞保留了病毒感知元素，但缺乏系统层面的协调，无法将病毒识别转化为适当的协调应答。WGCNA结果支持这一观点，即病毒应答基因虽被激活，但网络内协调性差，导致功能应答缺失。

IRF3和STAT1作为这一改变的抗病毒景观中的关键调控节点出现。尽管两者都是干扰素信号传导的核心介质且在感染成纤维细胞中被预测激活，但其功能相关性因细胞环境而异。在衰老IPF成纤维细胞中，更广泛的抗病毒网络协调不良可能降低对核心调控节点的依赖，使抗病毒控制对IRF3或STAT1等特定信号轴无响应。

这一模型为IPF患者对呼吸道病毒感染的临床脆弱性提供了合理解释。保留部分病毒感知但未能发起协调干扰素驱动的应答的成纤维细胞区室，可能通过削弱旁分泌免疫信号传导并扰乱已受损肺中损伤与修复的平衡来促进疾病恶化。

研究结论是：衰老IPF成纤维细胞被定义为一种功能失调的抗病毒成纤维细胞状态，其特征是保留病毒感知但干扰素应答受损。通过确定IRF3/STAT1相关信号传导作为IPF肺成纤维细胞环境中关键的缺失控制轴，这项工作也突显了衰老纤维化肺中潜在的治疗干预点。