《Letters in Drug Design & Discovery》：Circadian rhythm gene dysregulation in Alzheimer’s disease: An integrated transcriptomic analysis reveals novel therapeutic targets
编辑推荐：
背景：已发现昼夜节律基因（CRGs）参与阿尔茨海默病（AD）。方法：将GSE132903和GSE122063数据集分别作为训练集和验证集。应用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算CRG评分。研究人员将加权基因共表达网络分析（WGCNA）模块基因与limma
背景：已发现昼夜节律基因（CRGs）参与阿尔茨海默病（AD）。方法：将GSE132903和GSE122063数据集分别作为训练集和验证集。应用单样本基因集富集分析（ssGSEA）计算CRG评分。研究人员将加权基因共表达网络分析（WGCNA）模块基因与limma鉴定的差异表达基因（DEGs）取交集，随后应用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、递归特征消除（RFE）和XGBoost包算法进行特征筛选，保留前10个最重要的重叠基因用于进一步分析。通过受试者工作特征（ROC）曲线验证这些特征基因。此外，应用ssGSEA评估免疫浸润，使用NetworkAnalyst构建转录因子（TF）调控网络，采用Enrichr包进行药物预测，并使用AutoDockTools、AutoDock Vina和PyMOL进行分子对接模拟。结果：研究结果显示，疾病样本组的CRG评分显著降低。成功筛选出四个特征基因（FAM229B、SLCO3A1、CAPS和CERS1）。浸润分析显示疾病组具有更高程度的浸润。进一步研究显示，四个TF（NFKB1、SREBF1、NR3C1和FOXC1）与其中两个生物标志物相关。此外，对四个生物标志物的药物预测鉴定了28种潜在药物。随后，对17-Ethynylestradiol和genistein进行了分子对接模拟。结论：本研究鉴定了与AD相关的CRGs，可能为AD的早期诊断、干预和临床治疗提供新靶点和理论参考。
研究背景：阿尔茨海默病（AD）是一种进行性且不可逆的神经退行性疾病，主要表现为认知、情感、语言和记忆功能受损。AD患者脑组织中，由淀粉样β蛋白（Aβ）构成的细胞外老年斑和细胞内过度磷酸化tau（p-tau）聚集形成的神经原纤维缠结（NFT）是两大关键病理标志。AD已成为紧迫的全球健康问题；世界卫生组织（WHO）2022年痴呆研究蓝图估计全球约5520万人受该病影响。由于当前缺乏治愈性治疗，AD造成显著经济负担，因此亟需开发更有效治疗途径。AD具有较长无症状期，个体可表现病理指征但无认知或功能下降，给早期诊断带来挑战。尽管Aβ和tau可作为AD指标，但部分具有这些生物标志物的认知正常个体并不进展为临床AD，因此识别额外生物标志物对于更精确诊断和治疗十分必要。昼夜节律指生物体生物过程约24小时的内源性振荡，并受地球每日自转周期牵引，使生物和行为过程与外部时间环境同步。证据提示昼夜节律紊乱可能促进异常细胞增殖、增加基因突变概率、增强抗凋亡能力，并与睡眠障碍和神经退行性疾病高发相关。昼夜节律和睡眠-觉醒周期也参与Aβ调节；AD患者睡眠和昼夜节律障碍常见，睡眠问题影响高达45%的该人群。然而，昼夜节律紊乱与AD的精确关系仍待全面研究，需深入研究昼夜节律相关基因（CRGs）在AD中的改变。研究人员开展整合转录组分析以识别AD相关CRGs，深入分析所得生物标志物与免疫浸润的相关性，利用生物标志物构建转录因子（TF）调控网络，同时开展药物预测和分子对接研究。该整合方法期望识别AD检测和治疗新靶点，为临床管理提供潜在理论见解。研究结论认为，本研究初步鉴定四个与AD相关的CRGs；与单组学分析相比，该整合分析框架可能提高生物标志物筛选可靠性并帮助减少假阳性干扰；所鉴定的CRGs是AD早期准确诊断的新型候选生物标志物和潜在治疗靶点，可能促进靶向干预策略开发。重要意义在于为AD早期诊断、干预和临床治疗提供新靶点与理论参考。
关键技术方法：研究人员使用GEO来源的GSE132903训练集（97例AD、98例对照）和GSE122063验证集（56例AD、44例对照）；从既往研究收集48个CRGs；以R进行分析，采用ssGSEA计算CRG评分及28类免疫细胞富集评分；采用WGCNA识别AD相关共表达模块，limma筛选DEGs并将上调DEGs与模块基因取交集；采用LASSO、SVM-RFE和XGBoost三种机器学习算法筛选特征基因，并以ROC曲线验证；采用NetworkAnalyst基于JASPAR数据库构建TF-基因网络；采用Enrichr和DSigDB进行药物预测；采用AutoDockTools、AutoDock Vina和PyMOL对CAPS蛋白（PDB: 3E3R）进行分子对接。
研究结果：
3.1 基于WGCNA的CRGs筛选（Screening of CRGs based on WGCNA）：研究人员在GSE132903中以ssGSEA计算CRG相关评分，发现疾病样本组显著低于正常样本组，提示疾病样本组处于失调状态；以该评分作为性状进行WGCNA，识别10个共表达模块，其中MEbrown模块与CRGs正相关最强，保留其910个基因作为CRG相关模块；软阈值功率β=14时网络特征最佳，R
2=0.853，平均连通度为20。
3.2 CRG相关特征基因筛选（Screening of CRG-related feature genes）：通过limma在疾病样本与正常样本间筛选出261个下调DEGs和168个上调DEGs；将910个CRG模块相关基因与168个上调DEGs取交集，得到31个CRG相关重叠基因；LASSO回归在lambda.1se=0.0233时选择最优模型，RFE在保留25个特征时模型误差最小，XGBoost筛选前10个最重要基因；三种算法所得基因集交集得到FAM229B、SLCO3A1、CAPS和CERS1四个特征基因。
3.3 基因验证（Gene validation）：通过ROC曲线评估四个基因的诊断性能；在训练集GSE132903中，四个基因AUC均超过0.7，且疾病与对照组织间差异显著（p<0.0001）；在验证集GSE122063中，各基因AUC亦均超过0.7，且疾病与对照组织间差异显著（p<0.0001）；CAPS在两个数据集中的AUC均超过0.8，因此被选入后续研究；研究人员以四个基因表达水平为自变量，在训练队列和验证队列中建立四基因逻辑回归诊断模型，该联合模型在两队列中的AUC均超过任一单基因，表明多基因诊断策略有效整合互补信息并提高整体诊断性能。
3.4 免疫细胞浸润及其与生物标志物的相关性（Immune cell infiltration and its correlation with biomarkers）：通过ssGSEA比较病例组与对照组免疫浸润，结果显示病例组中活化未成熟B细胞、T滤泡辅助细胞、CD8 T细胞、中枢记忆CD8 T细胞、CD56bright自然杀伤细胞、肥大细胞、MDSCs、NK细胞、NK T细胞、浆细胞样树突状细胞、CD56dim自然杀伤细胞、未成熟树突状细胞、效应记忆CD8 T细胞、γδ T细胞、1型辅助T细胞、巨噬细胞、树突状细胞的免疫浸润评分更高（p<0.05）；相反，效应记忆CD4 T细胞在对照组中免疫浸润评分高于病例组（p<0.05）。进一步相关分析显示，四个生物标志物与NK T细胞、浆细胞样树突状细胞、T滤泡辅助细胞、巨噬细胞、MDSCs、单核细胞、NK细胞、CD56dim自然杀伤细胞、活化B细胞、活化CD8 T细胞、未成熟B细胞正相关，与活化CD4 T细胞、中枢记忆CD4 T细胞、效应记忆CD4 T细胞、2型辅助T细胞和嗜酸性粒细胞负相关（p<0.05）。
3.5 TF-基因调控网络（TF-gene regulatory network）：通过NetworkAnalyst预测hub genes的TF并构建TF-基因互作网络，网络由20个TF和4个hub genes组成；NFKB1与CAPS和CERS1相关，SREBF1与CERS1和SLCO3A1相关，NR3C1和FOXC1与SLCO3A1和FAM229B相关。
3.6 药物预测与分子对接（Drug prediction and molecular docking）：通过Enrichr和DSigDB对四个生物标志物进行药物预测，鉴定28种候选药物；其中17-Ethynylestradiol富集最显著（Combined Score=61.16），genistein因其已确立的神经保护作用及天然产物安全性而被选择；随后对17-Ethynylestradiol和genistein与CAPS蛋白进行分子对接，以评估其结合亲和力，原文报告了对接结果和结合能。
讨论部分总结：AD近年来日益与昼夜节律紊乱相关联，CRGs失调在AD进展中发挥重要作用。本研究成功识别四个关键生物标志物FAM229B、SLCO3A1、CAPS和CERS1。FAM229B（family with sequence similarity 229 member B）位于人类6号染色体长臂6q21；SLCO3A1（solute carrier organic anion transporter family member 3A1）与细胞周期进展密切相关，AD病理研究显示异常细胞周期激活是典型病理特征，AD患者脑内神经元呈进行性神经退行性变并伴细胞周期相关激酶显著增加，而昼夜节律控制细胞分裂并在多种生物中高度保守；CAPS（calcyphosine）是含EF-hand的蛋白，参与钙-磷脂酰肌醇和环磷酸腺苷（cAMP）信号级联及其他细胞功能，假说认为神经元钙稳态失衡与AD发病密切相关，异常钙信号可促进Aβ产生、tau过度磷酸化、突触损伤和神经元变性，本研究将CAPS识别为AD相关生物标志物，但仍需进一步实验证据明确CAPS是否直接参与AD发病；CERS1（ceramide synthase 1）在脑尤其是神经元中分子水平较高，其产物神经酰胺对膜流动性和细胞信号转导区室化有重要影响，并可激活特定蛋白激酶和磷酸酶，神经酰胺水平变化与多种疾病尤其神经退行性疾病密切相关，既往研究证实CERS1在AD患者中上调，昼夜节律与肝脏神经酰胺脱氢酶昼夜节律变化相关，提示CERS1及其产物神经酰胺可能参与昼夜节律调节并影响AD发病。四个TF亦同时与两个hub genes相关：NFKB1可被多种胞内外刺激激活，其介导的炎症反应在神经退行性疾病中关键，AD患者颞叶皮层、内嗅皮层和海马中NFKB1表达显著上调，NF-κB通路与AD发病密切相关，且NF-κB活性受昼夜节律调节，提示昼夜节律与炎症通路相互调节；SREBF1与脂肪酸合成、甘油三酯合成和胆固醇代谢相关，早晚期AD中SREBF1靶基因在蛋白和RNA水平下调，SREBP信号参与昼夜转录组重塑；NR3C1是应激反应系统关键组分，涉及多种精神障碍并为AD治疗潜在靶点，其通过不同翻译起始位点产生多种糖皮质激素受体（GR）亚型，部分如GR-C3与昼夜节律信号通路密切相关；FOXC1在胚胎发育和维持成体干细胞及祖细胞区室中重要，过表达FOXC1影响小胶质细胞介导的神经炎症，可能介导包括AD的神经退行性疾病。药物方面，本研究预测28种AD候选药物并选择17-Ethynylestradiol和genistein进行分子对接；17-Ethynylestradiol为合成雌激素，常用于避孕药制备，当前研究未详述其与AD直接联系，但已有研究表明雌激素可能影响包括AD的精神障碍，雌激素通过降低Aβ和谷氨酸毒性及tau过度磷酸化发挥神经保护作用；genistein为主要来源于豆科植物的植物雌激素和天然化学成分，不仅改善Aβ所致损伤、发挥抗氧化作用、清除AD产生自由基，还可直接与靶向信号蛋白相互作用并稳定其活性以对抗AD，实验显示高剂量genistein对AD小鼠有治疗作用，考虑到雌激素有致肿瘤副作用，genistein等选择性雌激素受体调节剂（SERMs）可能是更安全替代。局限性包括：所用数据集样本量有限，地理、种族和年龄分布多样性有限，可能引入偏倚并限制发现跨人群普适性；TF-靶基因互作调控关系仍需染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR、双荧光素酶报告基因实验和公共ChIP-seq数据集验证；四个AD相关CRGs来自计算分析，缺乏临床验证；28种预测候选药物中仅2种进行分子对接验证；未来需在细胞和动物模型中进行基因敲除或过表达以验证模型基因和候选药物功能，并开展随访临床队列分析探索其与认知障碍的相关性，从而为AD靶向治疗提供临床前和临床证据。
研究结论翻译：本研究初步鉴定四个与AD相关的CRGs。与单组学分析相比，该整合分析框架可能提高生物标志物筛选的可靠性，并有助于减少假阳性干扰。所鉴定的CRGs是AD早期和准确诊断的新候选生物标志物及潜在治疗靶点，可能促进靶向干预策略的开发。
