人源化血管芯片模型的最小构建要素：内皮-平滑肌双层共培养及剪切应力下屏障功能验证

《Life Sciences》：Minimal essentials for humanized vessel-on-a-chip model for vascular research

　　

研究人员构建的血管芯片呈现内皮细胞与平滑肌细胞的双层结构。芯片上的细胞维持其表型及细胞间通讯成熟度。该血管芯片可承受剪切应力并表现出通透性屏障功能。该芯片为血管研究模型提供了关键仿生要素。

研究背景与目的：心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）仍是全球主要死因，新药研发周期长、成本高且候选药物在临床试验中失败率较高；同时，许多CVD的生物学靶点和因果机制尚不清楚，部分原因在于临床前模型的有效性和可预测性不足。传统二维（2D）培养和动物实验难以充分复制人血管结构及微环境，因此需要更仿生、可重复的体外血管模型。血管芯片（vessel-on-a-chip）是结合细胞生物学、生物材料和组织工程的微流控三维（3D）平台，旨在复制人血管结构和生理反应。该研究基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）的生物相容性和低成本，采用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）与人血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMC）共培养，目标是建立简单、可重复的血管芯片方案，支持内皮与平滑肌双层空间分布、细胞连接、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）微环境和血管功能检测。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用PDMS微流控芯片构建圆形直通道及微血管/屏障芯片；按伦理批件（2023/021）从人脐带分离原代HUVEC与VSMC；在纤维连接蛋白/明胶包被表面顺序接种VSMC与HUVEC，并在VSMC成熟期加入原弹性蛋白（tropoelastin）促进弹性生成；以免疫荧光、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和流式细胞术表征细胞表型与ECM；连接蠕动泵施加低/高剪切应力；以70 kDa罗丹明B异硫氰酸酯-葡聚糖（Rh-dextran）评估表观通透性。

研究结果：
3.1 细胞分离与表征：通过流式细胞术、RT-qPCR和免疫荧光确认细胞身份。流式显示HUVEC约95% CD31阳性，VSMC约95% α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, αSMA）阳性；HUVEC中αSMA阳性约0.10%，VSMC中CD31阳性约0.48%。形态及CDH5、ACTA2表达确认两群细胞。结论：获得表型明确的原代细胞群，作为双层模型基础。
3.2 血管芯片：先在2D共培养中建立双层，免疫荧光3D重建显示约10–20 μm厚双层，VSMC位于0–10 μm，HUVEC位于5–20 μm，存在一定空间重叠；外加I型胶原未改善HUVEC黏附，提示共培养自身ECM足以支持黏附。RT-qPCR显示HUVEC主要表达IV型胶原、NID1、HSPG2、LAMA4/5，VSMC主要表达I/III型胶原和FN1；2D中HUVEC表达ELN。3D静态通道中细胞覆盖圆面并形成双层，免疫荧光显示elastin和collagen沉积。结论：模型在静态下可自产ECM并支持双层生长。
3.3 流动整合：连接蠕动泵施加低流（116 μL/min，0.14 dyn/cm²）和高流（1 mL/min，1.22 dyn/cm²）。低流20 h细胞保持贴壁；低流72 h HUVEC脱落、血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin, VE-cadherin）不连续，而VSMC稳定；低流后高流8–12 h改善VE-cadherin连续性和节点数。RT-qPCR显示高流下ACTA2和CDH5显著升高；COL1A1、FN1、HSPG2有升高趋势，ELN和LAMA5显著下降，其他不变；但Benjamini-Hochberg校正后ECM基因均不显著。结论：阶梯式流方案改善结构完整性并激活细胞。
3.4 内皮屏障功能：免疫荧光显示Jagged/Notch和Ephrin A1/EphR空间邻近，流下Jagged由核周点状重排为膜信号。通透性用70 kDa Rh-dextran在微血管/屏障芯片中检测；无细胞对照表观通透性持续上升，VSMC/HUVEC共培养先升后降，限制dextran通过；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）10 ng/mL预处理12 h改变细胞形态和连接，通透性高变异；时间与条件交互显著（F(4.00, 18.00)=162.15，p<0.0001），时间效应显著。结论：模型形成功能性内皮屏障并对TNF-α响应。

讨论总结：讨论指出该模型模拟内皮/平滑肌双层，保留ECM微环境和血管功能；顺序接种和tropoelastin促进VSMC成熟和弹性生成；低流稳定后高流对维持内皮完整性必要，长期低流损害内皮；通透性依赖细胞连接，TNF-α增加通透。局限包括：1 mm通道更接近小动脉/小静脉，PDMS刚性限制血管顺应性和跨壁压变化，仅含两种细胞而缺乏外膜和循环血成分，肌肉多层构建未成功，全通道成像受限。研究结论翻译：这是首批获得圆形几何、人内皮和平滑肌细胞共培养且具功能样特性的可重复3D血管芯片之一。无支架ECM产生和顺序接种成熟方案简化并加速制备，促进细胞间相互作用并保留各细胞类型功能。使用适配微流控的生物相容PDMS芯片，研究人员在8–9天内获得融合成熟VSMC/HUVEC双层，其ECM可适应最高1 mL/min（1.22 dyn/cm²壁剪切应力）的培养基流，增加血管和微流控研究的生理相关性。该模型可作为细胞和分子研究的潜在生物工具，在比传统细胞培养更仿生的微血管环境中进行；通透性可测，其他功能试验可适配。