紫草素通过PKM2-AMPK-PGC1α代谢轴促进多发性骨髓瘤细胞凋亡

《JOURNAL OF CLINICAL LABORATORY ANALYSIS》：Shikonin Promotes Apoptosis in Multiple Myeloma Cells Through the PKM2-AMPK-PGC1α Metabolic Axis

　　

背景 多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种不可治愈的浆细胞恶性肿瘤。丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2, PKM2）是糖酵解限速酶，参与肿瘤代谢重编程。紫草素（shikonin）是一种天然化合物，具有抗癌潜力。然而，以紫草素调控PKM2能否作为MM的辅助化疗策略尚待阐明。研究人员探讨了紫草素对MM细胞代谢途径的影响。方法 采用流式细胞术分析紫草素处理MM细胞的凋亡、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生及细胞周期进程。将紫草素处理的MM细胞送检RNA测序和LC–MS/MS代谢组学。采用蛋白质印迹（western blotting）验证相关信号通路。结果 coMMpass队列分析表明，PKM2高表达与MM细胞生存不良相关。紫草素剂量依赖性诱导MM细胞凋亡、升高ROS水平并引起G₁期细胞周期阻滞。多组学分析显示，紫草素处理MM细胞中有2043个差异表达基因和93个改变代谢物。紫草素下调PKM2表达，进而降低丙酮酸/AMP水平并损害糖酵解。整合组学分析确定AMPK信号为共同富集通路。WB证实紫草素抑制PKM2和GLUT4表达并激活P-AMPK/PGC1α表达，表明PKM2-AMPK-PGC1α轴失调。结论 紫草素通过抑制PKM2表达、破坏糖酵解通量、激活AMPK/PGC1α介导的代谢应激并触发凋亡过程，在MM细胞中发挥抗肿瘤作用。以紫草素抑制PKM2是MM治疗中有前景的代谢干预策略。

多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种不可治愈的骨髓浆细胞克隆性增殖性血液肿瘤。尽管新型免疫治疗取得进展，耐药和严重副作用仍然存在。MM细胞代谢重编程参与耐药形成，肿瘤细胞依赖有氧糖酵解和谷氨酰胺分解维持生长、生存及治疗抵抗。既往研究提示耐药浆细胞可向脂肪酸氧化转变，因此调控MM细胞代谢状态并联合抗肿瘤药物可能成为改善患者结局和生存的策略。传统中药（traditional Chinese medicine, TCM）是新型抗肿瘤药物的重要来源。紫草素（shikonin）为从紫草根中分离的天然化合物，既往在多种肿瘤中显示抑制增殖、迁移及诱导凋亡、自噬和坏死性凋亡等潜力；在MM中已有研究涉及胰岛素样生长因子受体信号、蛋白酶体抑制和坏死性凋亡、铁死亡等，但紫草素如何影响MM细胞代谢以及以紫草素调控丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2, PKM2）能否作为辅助化疗策略尚不清楚。为回答该问题，研究人员以MM细胞为对象，结合转录组学与代谢组学探究紫草素相关信号通路，分析PKM2下调抑制MM细胞的机制，并为紫草素治疗MM提供依据。研究结论表明，紫草素通过抑制PKM2表达、破坏糖酵解通量、激活AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha, PGC1α）介导的代谢应激并触发凋亡，在MM细胞中发挥抗肿瘤作用；以紫草素抑制PKM2是MM治疗中有前景的代谢干预策略，意义在于提出针对MM代谢重编程的干预方向。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用人骨髓瘤细胞系RPMI-8226和U266；以不同浓度紫草素处理后，用流式细胞术检测凋亡、ROS产生和细胞周期；对紫草素处理（0和2.5 μM）的RPMI-8226细胞进行RNA测序和LC–MS/MS代谢组学，并行基因与代谢物富集及整合分析；用蛋白质印迹（western blotting, WB）验证AMPK相关通路蛋白。生存分析基于coMMpass队列。每组样本设三个重复，数据以GraphPad Prism 8行t检验或单因素方差分析，p<0.05为差异有统计学意义。

3.1 高PKM2表达预示MM不良预后，紫草素诱导MM细胞凋亡。coMMpass队列分析显示PKM2高表达与MM患者不良预后相关，ISS II和III期高表达患者结局较差；紫草素升高MM细胞ROS水平，提示氧化磷酸化受损并导致肿瘤细胞死亡；紫草素浓度依赖性诱导凋亡；不同浓度紫草素使细胞周期阻滞于G₁期，因进入S期进行DNA合成受阻而触发凋亡；紫草素抑制PKM2蛋白表达。3.2 紫草素处理MM细胞的RNA测序与代谢组关联分析。RNA测序火山图显示2043个差异表达基因，其中1347个上调、696个下调；基因本体（Gene Ontology, GO）富集显示生物学过程前3为血管生成、细胞外基质组织和白细胞外流，细胞组分显著富集细胞外基质和蛋白细胞外基质，分子功能显著富集受体结合和蛋白结合；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析前10包括铁死亡、细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK、PI3K-Akt、NF-κB、JAK-STAT、Ras、B细胞受体、TNF、AMPK和IL-17信号通路。代谢组检测437个代谢物，主成分分析（principal component analysis, PCA）比较组间分布，热图显示差异代谢物，火山图显示14个上调、79个下调差异代谢物；KEGG前10包括蛋白质消化吸收、癌症中心碳代谢、碳代谢、辅因子生物合成和氨基酸生物合成。代谢组分析显示紫草素给药后丙酮酸和AMP浓度下降，提示MM细胞糖酵解受损。3.3 PKM2参与紫草素处理MM细胞的AMPK代谢轴。Spearman相关热图展示前20差异指标相关系数矩阵；PCA比较代谢组与转录组样本差异；典型相关分析（canonical correlation analysis, CCA）展示前20差异代谢物与相关基因的CCA相关矩阵，并绘制|r|>0.8的代谢物-基因相关网络图；Venn图显示两 omics 共享129条通路；差异代谢物与相关差异基因KEGG气泡图显著富集AMPK信号通路及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。综上，代谢组与转录组相关分析提示紫草素主要影响AMPK通路。WB验证显示MM细胞中PKM2和GLUT4蛋白水平降低，表明紫草素抑制PKM2表达；PGC1α和P-AMPK蛋白水平逐渐升高，证实PKM2参与AMPK信号通路。紫草素通过抑制PKM2表达诱导MM细胞凋亡；细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）产生显著减少、谷胱甘肽合成受抑，导致细胞抗氧化防御系统崩溃、ROS蓄积和凋亡通路激活；PKM2抑制还使细胞周期阻滞于G₁期，从而促进MM细胞凋亡。

讨论总结：讨论指出TCM多靶点、副作用少；本研究显示MM患者PKM2上调与不良预后相关，紫草素抑制PKM2并促进线粒体功能障碍、氧化应激上调和细胞周期阻滞的MM细胞凋亡，通过PKM2-AMPK-PGC1α通路破坏代谢重编程和能量稳态。代谢组显示紫草素后丙酮酸和AMP下降，糖酵解受损；AMP作为细胞能量指标激活AMPK并作为磷酸果糖激酶-1（phosphofructokinase-1, PFK-1）关键变构激活剂，PFK-1催化果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate, F6P）转化为果糖-1,6-二磷酸（fructose-1,6-bisphosphate, F1,6BP），是糖酵解关键限速步骤之一；因此紫草素下调AMP可能减弱PFK-1激活，导致糖酵解通量下降和丙酮酸产生减少。讨论还总结紫草素在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、帕金森病、炎症性皮肤病等中的抗肿瘤/作用证据，以及纳米药物、联合JQ1、顺铂等联合策略提高生物利用度、靶向性和疗效并降低全身副作用；紫草素可介导程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1, PD-L1）降解、调节NK细胞等免疫作用，并在晚期肺癌患者中未见明显外周血、心肝肾功能不良反应。讨论强调紫草素可能作为MM辅助治疗，尤其为复发/难治MM克服耐药提供思路，但需进一步联合研究验证。PKM2与PD-L1表达、CD8⁺ T细胞免疫代谢、MM耐药、CD147及MM骨病中骨髓间充质干细胞PKM2表达相关；紫草素调控PKM2可能改善MM骨病和免疫环境。药代动力学方面，大鼠静脉5 mg/kg紫草素最大血药浓度0.29 μM，口服后0.5 h约1.66 μM，本实验0.5–2.5 μM与临床前系统暴露水平重叠；但药代数据主要来自啮齿类，大动物/非人灵长类系统药代数据有限；紫草素溶解性、稳定性和脱靶效应需优化。研究仅体外评估，需在MM异种移植模型和患者来源样本中评估疗效安全性及代谢变化能否在体内重现；PKM2-AMPK-PGC1α轴之外可能还有其他信号通路参与，需进一步研究。

研究结论翻译：MM中PKM2高表达与不良预后相关。紫草素是一种有前景的PKM2调节剂，可用于MM治疗，提供独特的代谢干预策略以改善耐药、骨病和免疫微环境。