DNA初免—腺病毒载体口咽喷雾加强免疫策略抗呼吸道合胞病毒的验证性双中心非人灵长类研究——重要经验教训

《JOURNAL OF MEDICAL PRIMATOLOGY》：A Confirmatory, Dual Center Nonhuman Primate Study on the Efficacy of Novel Oropharyngeal Spray Immunization With an Adenoviral Vector Vaccine Against RSV—Important Lessons Learned

　　

摘要 背景：在一项随机、盲法、双中心研究中，研究人员在两个欧洲灵长类研究中心评估了针对呼吸道合胞病毒（RSV）的DNA初免—口咽腺病毒加强免疫策略的免疫原性和保护效力。 方法：恒河猴首先通过电穿孔接种编码RSV融合蛋白（F）的DNA疫苗，随后两次经黏膜给予编码相同抗原的重组腺病毒载体。对照组包括模拟疫苗接种动物以及一组模拟自然感染RSV后所诱导免疫力的比较组。纵向监测全身和黏膜免疫应答。 结果：研究人员检测到强烈的细胞和体液免疫应答，但在两个中心之间存在一定差异。尽管如此，RSV疫苗接种动物在RSV攻毒感染后，其上呼吸道和下呼吸道的病毒复制显著减少。由于在一个研究地点对照组出现了意外的RSV特异性免疫力，导致预设的主要终点未能得到确认。 结论：本研究结果支持DNA初免后进行黏膜腺病毒加强可诱导针对RSV的保护性免疫力这一潜力，同时揭示了多中心临床前疫苗研究面临的挑战。

研究背景与目的

呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus, RSV）是导致婴幼儿、老年人和免疫功能低下者急性下呼吸道感染的主要病原体，几乎所有儿童在2岁内均会感染，全球每年约300万例急性下呼吸道感染事件，导致5岁以下儿童死亡约6万例。自然感染无法诱导持久的保护性免疫，因此开发高效、长效的RSV疫苗一直是领域内的重点课题。截至2022年，唯一的预防措施是针对高危儿童的帕利珠单抗（Palivizumab）被动免疫。2023年，FDA批准了两款基于稳定化prefusion RSV-F蛋白的疫苗Arexvy（GSK）和ABRYSVO（Pfizer）用于老年人，此外ABRYSVO获批用于孕产妇免疫以保护新生儿，Moderna的mRNA疫苗也补充了现有预防手段。然而，这些被动免疫和肌肉注射疫苗无法在上呼吸道产生持久的黏膜免疫，而上呼吸道正是RSV等呼吸道病毒入侵和早期复制的首要部位，因此对阻断病毒传播效果有限。为此，大量研究致力于开发能诱导黏膜免疫的新型疫苗策略。研究人员此前曾证明，在非人灵长类（Nonhuman Primate, NHP）中，采用肌肉注射DNA免疫联合口咽喷雾腺病毒载体的方案可诱导针对RSV-F的长效黏膜免疫。为进一步验证该方案的保护效力，本研究设计了一项更紧凑、严格的免疫程序，并在两个欧洲灵长类中心开展随机、盲法NHP研究，旨在提高外部有效性。

研究方法与关键技术

本研究是一项在德国灵长类中心（German Primate Centre, DPZ）和荷兰生物医学灵长类研究中心（Biomedical Primate Research Centre, BPRC）开展的随机、盲法、双中心NHP研究。共纳入36只成年恒河猴（DPZ 24只，BPRC 12只），分为三组：RSV疫苗组（DNA初免+两次Ad5-F口咽喷雾加强）、Mock对照组（编码流感抗原的相同载体）和比较组（先感染RSV模拟自然免疫）。主要技术方法包括：通过电穿孔进行肌肉注射DNA疫苗；使用MADgic喉气管黏膜雾化装置进行口咽喷雾腺病毒载体免疫；利用流式细胞抗体结合实验和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清和支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF）中的RSV-F特异性IgG和IgA抗体；采用重组荧光素酶标记RSV进行中和抗体检测；通过细胞内因子染色（Intracellular Cytokine Staining, ICS）分析BAL细胞中抗原特异性CD4和CD8组织驻留记忆T细胞（Tissue-Resident Memory T cell, T_RM）反应；利用IFN-γ ELISpot检测外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）中的T细胞反应；通过qRT-PCR测定攻毒后上、下呼吸道样本中的病毒RNA拷贝数。

研究结果

3.1 比较组的初次RSV感染

比较组动物在第8周接受RSV感染。DPZ动物上呼吸道病毒RNA拷贝数为10⁶–10⁹/mL，BALF中为10³–10⁶/mL，组内变异较小；而BPRC动物整体病毒复制水平较DPZ低1–2个数量级，其中两只动物几乎未感染。所有比较组动物在第12周均发生血清学转换。

3.2 体液免疫应答

RSV疫苗组所有动物均发生血清学转换，但动力学和强度存在中心差异：DPZ动物在DNA免疫后7周内全部产生RSV-F特异性IgG，而BPRC仅有1/4动物在该阶段血清学转换，但最终峰值水平相近（30–70 μg/mL）。DPZ的Mock组动物在第10–12周出现RSV-F特异性IgG血清学转换，而BPRC的Mock组在整个免疫阶段保持阴性。值得注意的是，初次RSV感染未能诱导显著的黏膜抗体应答，而RSV疫苗组中DPZ动物的BALF中可检测到F特异性IgG和IgA，峰值出现在第二次黏膜加强后2周，之后逐渐下降；BPRC动物的BALF中则缺乏F特异性抗体。中和抗体检测结果与结合抗体一致，DPZ RSV疫苗组中和滴度最高，约为BPRC同组的3倍，而BPRC动物的BALF中未检测到中和活性。

3.3 细胞免疫应答

DPZ动物的新鲜PBMC ELISpot结果显示，DNA免疫已在第4周引发所有RSV疫苗接种动物的系统性T细胞应答。第一次黏膜加强后仅检测到少量IFN-γ产生细胞，而第二次黏膜加强引发了强烈的回忆反应，多数动物达到斑点形成细胞数量的峰值，随后逐渐下降至第39周。比较组在初次感染后诱导了短暂的系统性T细胞应答，但攻毒前1周所有Mock组和比较组动物均无可检测水平的IFN-γ产生T细胞。BAL细胞的ICS分析显示，RSV疫苗组在第二次加强后2周（第30周）达到峰值，表现为高比例的细胞因子阳性CD4和CD8 T细胞。在几乎所有RSV疫苗接种动物（两个中心）的BAL中均可检测到产生IFN-γ的CD4 T_RM，频率范围为1%–23%。比较组在感染后2周也可检测到抗原特异性CD4和CD4 T_RM，但随后逐渐下降至攻毒前消失。CD8 T细胞应答趋势与CD4相似，但检测频率较低。

3.4 疫苗效力

攻毒实验显示，BPRC的Mock组动物上呼吸道病毒RNA拷贝数较高，RSV疫苗组几乎完全保护（仅2份鼻拭子样本在攻毒后第3天略高于检测限），比较组也有部分保护。DPZ的结果类似，但DPZ的Mock组显示出明显低于BPRC Mock组的病毒载量，其动力学和水平与比较组二次感染后相似，与该组先前检测到的抗F免疫一致。综合两个中心的总体病毒RNA曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）分析，RSV疫苗组与Mock组在上、下呼吸道均存在显著差异，但病毒载量水平因中心而异。下呼吸道感染非常有限，仅在BPRC的4只Mock动物中检测到极低水平的病毒RNA。攻毒后的抗体分析显示，DPZ的RSV疫苗组几乎没有RSV-F特异性抗体升高，而比较组和Mock组表现出更强的回忆反应，表明病毒复制受限较少。BPRC的Mock组在攻毒后也产生了F特异性抗体，但水平低于其他两组，且几乎无中和活性。

讨论与结论

本研究作为一项验证性双中心NHP研究，证实了异源初免-加强方案具有高度免疫原性，能够诱导黏膜免疫并保护后续RSV感染。然而，研究也遇到了重大挑战：DPZ的Mock组意外发展出RSV特异性免疫力，最可能的解释是动物设施内发生了RSV水平传播，这导致该中心未能确认预设的主要终点。此外，两个中心在麻醉方案上的差异可能影响了病毒/疫苗在黏膜表面的暴露时间和抗原表达效率，进而导致了体液免疫（尤其是黏膜抗体）响应的差异。尽管面临这些困难，RSV疫苗接种动物（无论中心）的病毒复制几乎完全被抑制，这凸显了系统性中和抗体与F特异性T_RM快速激活的协同保护作用。研究结论指出：本双中心NHP研究虽因实验过程中不可预见的障碍未能达到主要终点，但仍为改进黏膜疫苗对抗新兴或再现呼吸道病原体的潜力提供了证据，有助于改善大流行防范准备。同时，该研究为未来多中心动物实验的设计提出了警示。