Recordanelle：人类细胞中全转录组单细胞RNA记录的合成细胞器系统

《Nature Biotechnology》：Recordanelles for transcriptome-wide single-cell RNA recording in human cells

转录组测量技术为理解生物学提供了强大手段，但其局限性在于只能在某一时刻提供高分辨率快照，或提供狭窄时间范围内受限于少数基因的低分辨率转录历史。本文介绍了一种名为“recordanelle”的单组分合成细胞器，它能够在人类细胞中记录转录组。Recordanelle由线粒体膜锚（mitochondrial membrane anchor）、凝聚物组装器（condensate assembler）和poly(A)结合蛋白（poly(A)-binding protein）组成。研究人员证明，recordanelle可以被工程化以招募工程化RNA或对高达90%的内源mRNA进行采样，并在数天内保护它们。研究人员进一步证明，由诱导型启动子或干扰素（interferon, IFN）信号传导产生的瞬时和动态转录响应，能够在单细胞水平上在recordanelle内随时间保存。这项工作提供了一种非破坏性且无偏的全转录组单细胞RNA记录技术，有助于更深入地理解生物学。

细胞通过动态调控基因转录以协调发育并适应胞内外信号。然而，当前大多数转录测量手段均具有破坏性，只能捕获静态快照。代谢标记或酶学标记策略虽能赋予时间分辨率，但受限于缺乏连续转录组采样、依赖间接推断转录活性、输入量要求高且难以大规模扩展。基于DNA的分子记录方法可将瞬时信息编码入DNA，实现基因表达事件的事后重建，但主要局限于原核系统或极少数靶基因。因此，真核细胞中亟需一种非破坏性、无偏且覆盖全转录组尺度的RNA记录方法。

受生物分子凝聚（biomolecular condensation）原理启发，研究人员设计了“recordanelle”（RNA记录细胞器），一种由单一蛋白构成的基因编码合成细胞器，能够在线粒体表面形成保护性环境，无偏地招募并储存内源细胞质RNA。该蛋白包含三个功能组件：通用RNA结合结构域（RBD）、生物分子凝聚物组装结构域和线粒体膜锚。结合RNA测序（RNA-seq），该系统可重建含recordanelle细胞的基因表达历史。经系统优化，最佳架构recordanelleV2由TOM20^1–70线粒体锚、TAF15N组装肽与PABPC4?C^161A mRNA结合结构域组成，可富集高达90%表达转录本，在数天内保护瞬时表达信号，并能在单细胞水平记录由合成诱导物或干扰素（IFN）信号传导引发的动态转录事件，且不显著改变细胞生理。该成果发表于《Nature Biotechnology》。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过模块化克隆构建膜锚－组装肽－RBD三元融合蛋白文库；在HEK293T细胞（美国模式培养物保藏所，ATCC CRL-3216）中进行瞬时转染以筛选最佳架构；运用RNA荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）验证recordanelle的线粒体定位及RNA招募；利用差速离心法分离线粒体组分以富集recordanelle，并通过qPCR定量富集效率；采用添加外源RNA标准品（ERCC）的bulk RNA-seq实现转录组全局量化；借助10x Genomics平台完成单细胞RNA-seq，结合Seurat/Harmony分析鉴定稀有细胞亚群；最后通过定量蛋白质组学与Seahorse代谢分析全面评估recordanelle表达对细胞生理和线粒体功能的影响。

**RBDs efficiently capture selected RNAs within recordanelles**：通过FISH和qPCR定量证明，以MCP或PCP为RBD的recordanelle能在线粒体表面凝聚体中特异招募对应的ms2或pp7茎环标记RNA，富集效率达3–11倍；RNA-seq进一步确认全细胞转录组无显著扰动，说明该系统不干扰细胞转录状态。

**Capturing endogenous transcripts within recordanelles with poly(A) binders**：将序列特异性RBD替换为poly(A)结合蛋白（如PABPC4、PABPC1和LARP1）后，内源mRNA在recordanelle组分中富集可达15倍；利用不含RBD的对照证实，该招募依赖于功能性mRNA结合结构域，而非组装肽造成的非特异吸附，从而将recordanelle从靶向单基因推广至广谱内源RNA捕获。

**Transcriptome-wide recording with recordanelles**：结合ERCC标准品的bulk RNA-seq显示，TAF15N/PABPC4组合可富集相当于约90%表达基因的转录本，而FUSQG体系约为64%；富集样本与全细胞转录组高度一致，表明recordanelle以近似无偏的方式采样胞质转录组，且未改变全细胞RNA水平。

**Recordanelles record transient gene expression events**：在强力霉素（Dox）诱导的mCherry::ms2报告细胞系中，recordanelleV1和recordanelleV2在Dox撤除后1–2天仍可检出瞬时转录本，而对照体系信号完全衰减；通过recordanelle纯化可显著提升瞬时基因表达事件的检测灵敏度，且recordanelleV2不改变报告基因的初始表达水平。

**Recordanelles enable the reconstruction of transient immune signaling**：以IFN-β刺激触发干扰素刺激基因（ISG）表达后，对照细胞2天内信号完全消失；recordanelleV2在2天后仍保留100%的差异表达基因，并可通过Gene Ontology分析重建完整的IFN-β响应通路，信号可持续记录至第5天；定量蛋白质组学确认并未造成持续的炎症状态。

**Recordanelles do not affect viability or disrupt mitochondrial function**：对ATP产量、细胞凋亡、线粒体膜电位、有氧呼吸及线粒体呼吸链蛋白质复合物的系统检测显示，recordanelle表达均未造成显著改变，满足“最小扰动”的设计标准。

**Recordanelles capture immune signaling at the single-cell level**：单细胞RNA-seq鉴定出IFN-β响应细胞簇（IRC）；仅recordanelleV2在刺激撤除2天后仍保留该细胞簇及ISG表达模块，而MCP对照中的信号完全消失，证明recordanelleV2能够以单细胞精度记录内源免疫信号。

讨论部分指出，recordanelle本质上仍是对细胞的一种扰动系统，包括转基因表达负担、线粒体膜表面占位、RNA结合所引入的人为相互作用以及信息存储的热力学成本；未来应用需要关注这些扰动对生物学解读的潜在影响。与传统基于DNA/RNA/蛋白质编码的记录策略不同，recordanelle以“未修饰生物学原件连续存储”的方式工作，仅需表达约91 kDa（2.5 kb）的单一蛋白，便于慢病毒或腺相关病毒递送，且具备可扩展、无偏、快速、连续和可调的优势。与同期报道的TimeVault工具相比，后者基于游离vault颗粒且主要捕获24小时表达快照；recordanelle则通过膜锚定生物分子凝聚物实现任意时间窗的连续记录，更适合超过24小时且精确时间未知的生物学问题。研究结论表明：recordanelle能够在单个活哺乳动物细胞中连续、无偏地记录全转录组的时间历程，保留传统快照方法无法获取的瞬时信息，为理解健康和疾病背景下的细胞功能提供了更深入的机会。