单细胞解析炎症抑制与干性可塑性：STMN1+恶性上皮细胞在重症肺癌中的关键作用

《Chemical Biology & Drug Design》：Single-Cell Dissection of Inflammatory Suppression and Stemness Plasticity Reveals STMN1-Associated Malignant Epithelial Cells in Severe Lung Cancer

晚期肺癌伴恶性浆膜腔积液（advanced lung cancer with malignant serous effusions, ALC-MSE）患者的病程复杂，治疗结局难以预测；目前仍缺乏对该状态肿瘤干细胞样特征及调控机制的系统研究。基于单细胞转录组（single-cell transcriptomics）数据和TCGA-LUAD（The Cancer Genome Atlas Lung Adenocarcinoma）队列，本研究系统分析了重症肺癌中恶性上皮细胞的功能特征和关键调控网络。主要发现包括：重症肺癌上皮细胞中炎症和免疫相关信号通路（包括NF-κB、TNF和JAK–STAT信号通路）显著减弱，干细胞样特性增强并伴代谢重编程；研究人员鉴定出一个高度干细胞样的恶性上皮细胞亚群，以Cluster 3为代表，该亚群富集于Notch、Hippo、TGF-β和FoxO等干细胞样通路，并伴随线粒体代谢和应激适应能力增强；STMN1是调控该干细胞样状态的关键分子，与干性评分和mRNAi呈显著正相关；STMN1高表达细胞获得生存优势，并可能通过减弱与其他细胞的癌相关成纤维细胞/细胞外基质（cancer-associated fibroblasts/extracellular matrix, CAF/ECM）信号（COL1A1-CD44）、抑制补体激活和抗原呈递信号（如C3、ANXA1和MHC-II相关分子）以及增强干性龛信号（MIF-CD74/CD44）来维持其干性。此外，NELFE、MYBL2、FOXN3、POLR2A和RAD21被鉴定为STMN1的潜在上游调控因子。体外实验证实，在诱导干细胞样特性后，STMN1在肺腺癌细胞中显著过表达，并伴随相关干细胞标志物（SOX2、NANOG、OCT4和CD44）上调。总之，本研究揭示了晚期肺癌恶性上皮细胞中显著增强的干性状态，伴随炎症信号抑制和代谢适应增强，并鉴定STMN1为驱动干性维持和疾病进展的关键分子。

研究背景：重症肺癌（severe lung cancer）是晚期肺癌中病情危重、预后极差的高风险状态；按国际共识，其主要包括东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）体能状态（Performance Status, PS）评分为2–4分的患者，肿瘤相关并发症、治疗相关不良事件和急性合并症常交织，临床病程复杂且治疗反应难以预测。肿瘤干性（cancer stemness）指肿瘤细胞获得自我更新和多向分化等干细胞样特性，癌症干细胞（cancer stem cells, CSCs）是异质性、治疗抵抗、转移和复发的重要来源；干性具有可塑性，缺氧、化疗、氧化应激等微环境应激可促使分化肿瘤细胞去分化并重获干细胞样状态，Notch、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR、Hippo、TGF-β和FoxO等通路共同维持CSCs。晚期肺癌患者常存在全身缺氧、酸中毒、细胞因子风暴和多线治疗诱导的微环境重塑，HIFs和NF-κB等可将缺氧与CSCs联系起来。然而，重症肺癌的分子病理生理认识仍有限；炎症和缺氧是否在单细胞分辨率上驱动重症肺癌肿瘤细胞干性增强尚缺乏系统研究，普通肺癌中的干性调控机制能否外推至重症状态亦不明确。因此，研究人员利用单细胞转录组联合TCGA-LUAD队列，系统分析晚期肺癌恶性上皮细胞的干性特征及潜在调控机制，目标是识别高干性恶性上皮细胞亚群并探讨免疫/炎症信号改变、筛选维持高干性亚群的关键分子、研究STMN1在肺腺癌干性调控中的作用及其上下游机制，为理解重症肺癌分子机制和精准治疗策略提供理论依据。

关键技术方法（≤250字）：采用GEO GSE131907单细胞队列（44例患者、58份肺腺癌样本，含正常肺、早期、晚期及ALC-MSE样本，ALC-MSE依据标识EBUS_06识别）和TCGA-LUAD队列（540份肿瘤样本），并在GSE189357独立单细胞队列验证；使用Seurat/Harmony进行降维聚类和注释，decontX质控，fastCNV/inferCNV判定恶性上皮细胞，CytoTRACE/CytoTRACE2评估干性，OCLR构建mRNAsi，Monocle2进行拟时序分析，CellChat分析细胞通讯，pySCENIC筛选上游转录因子；体外以A549肿瘤球形成富集干性细胞，结合qRT-PCR、Western blot及STMN1敲低/过表达和NELFE抑制剂处理。

研究结果：
3.1 重症肺癌患者肿瘤组织中的上皮细胞表现出显著异常增殖：通过单细胞图谱获得100,217个细胞、27个簇并注释为8类主要细胞，比较细胞比例发现上皮细胞/B细胞比例在早期、晚期和重症组升高，髓系细胞比例降低，T细胞和肥大细胞在早期升高而在晚期和ALC-MSE降低，提示重症肺癌上皮细胞异常增殖及免疫细胞构成改变。
3.2 肺癌进展中上皮细胞的阶段特异性炎症信号变化：通过GSEA比较ALC-MSE与晚期、早期、正常肺及晚期与正常肺，发现ALC-MSE上皮细胞中PI3K-Akt、MAPK、JAK–STAT、NF-κB、IL-17、TGF-β等炎症/免疫通路及细胞黏附、谷胱甘肽和甘油酯代谢受抑；相较早期，炎症通路持续抑制而细胞周期上调；相较正常肺，细胞周期、DNA复制、同源重组和Fanconi贫血通路激活而MAPK、PI3K-Akt、NF-κB、TNF等下调；晚期相较正常肺细胞周期、核苷酸/嘧啶代谢、p53和细胞衰老激活，而PPAR、胆固醇、脂肪酸、Th17、补体凝血和TGF-β受抑。结论为ALC-MSE存在炎症/免疫信号协同抑制与代谢功能障碍，可能利于持续增殖和免疫逃逸。
3.3 恶性上皮细胞的整合识别及其炎症与干性特征刻画：通过上皮亚聚类获得11个亚群，结合fastCNV、肿瘤来源及上皮/正常肺/肿瘤相关标志物，将Cluster 0、3、4、5、8、9判为恶性上皮群体；恶性上皮比例由早期向晚期及重症逐渐升高，重症最高。差异富集显示恶性上皮细胞富集PI3K-Akt、MAPK、Ras、NF-κB、TNF、IL-17及FoxO、Hippo、mTOR、细胞周期、DNA复制、p53、碱基切除修复和核苷酸代谢；CytoTRACE2显示重症组织干性评分显著升高，Cluster 3干性最高，4和9次之，0、5、8较低，提示重症恶性上皮细胞向低分化、干细胞样状态转变。
3.4 轨迹分析识别恶性上皮细胞中不同的炎症与干性相关状态：通过对6个恶性簇进行KEGG分析，Cluster 3富集干细胞多能性、Notch、Hippo、TGF-β、FoxO及氧化磷酸化、TCA循环和线粒体自噬，提示高自我更新、线粒体代谢依赖和应激适应；Cluster 4/9富集代谢重编程和能量适应，Cluster 5富集治疗抵抗，Cluster 0/8富集炎症激活和免疫炎症信号。Monocle2拟时序显示Cluster 0和8主要位于中间/终末状态，Cluster 3主要位于起始State 4；细胞比例显示Cluster 0在晚期肺癌最高（>50%），Cluster 3在重症样本最高；State 4特异基因富集线粒体能量代谢、氧化应激、蛋白加工/稳态和干性维持。结论为高干性群体优先富集于重症肺癌并具更强代谢适应和生存优势。
3.5 STMN1作为恶性上皮细胞干性相关基因的鉴定与独立验证：通过State 4与ALC-MSE上皮细胞共上调基因（1392个）及CytoTRACE2相关分析筛选候选基因，STMN1与mRNAsi正相关最强并优先表达于高干性Cluster 3和State 4；STMN1与MKI67、TOP2A、S.Score、G2M.Score正相关，校正细胞周期评分后其与CytoTRACE2的相关仍显著（由0.54降至0.452），单变量回归中STMN1解释CytoTRACE2方差（R²=0.428）高于TOP2A（R²=0.064）和MKI67（R²=0.038），低增殖组相关R=0.32、高增殖组R=0.64；GSE189357中Cluster 2的STMN1最高且CytoTRACE2较高。结论为STMN1标记兼具干性增强和增殖特征的恶性上皮状态。
3.6 STMN1高表达恶性上皮细胞表现出基质和免疫通讯重塑：通过CellChat比较Ep-STMN1+（Cluster 3）、Ep-STMN1?（Cluster 0、4、5、8、9）和EP-NM，成纤维细胞为主要通讯伙伴但Ep-STMN1+总体互作强度较低；Ep-STMN1+中PLAU–PLAUR、PDGFA–PDGFRB、GAS6–AXL、FN1–ITGAV/ITGB1、COL1A1–CD44及LGALS9–P4HB、IGFBP3–TMEM219、APP–CD74等ECM/黏附和应激相关互作减弱，而MIF–CD74/CD44、LAMA3/LAMC1–CD44、COL2A1–CD44等干性相关互作增强；C3–C3AR1、C3–(ITGAX+ITGB2)、C3–(ITGAM+ITGB2)、APOE–TREM2、ANXA1–FPR1/FPR3及HLA-II相关互作在Ep-STMN1+中明显减少或缺失；以STMN1中位表达分组重复分析仍保留主要特征。结论为STMN1+恶性上皮细胞呈基质/免疫参与降低、干性相关信号增强的通讯状态。
3.7 预测可靶向调控STMN1活性的上游转录因子：通过转录因子-靶基因关联矩阵筛选出8个潜在转录因子，再经Spearman相关（cor.rho>0.3、校正p<0.05）确定NELFE、MYBL2、FOXN3、POLR2A、RAD21为关键因子；NELFE、POLR2A、RAD21表达模式与STMN1高度一致，均在Cluster 3最高，并在ALC-MSE患者中显著升高。结论为NELFE、POLR2A和RAD21可能是调控高干性Cluster 3中STMN1高表达的关键上游转录因子。
3.8 STMN1在干性富集的A549细胞中表达升高：通过肿瘤球形成实验富集A549干性细胞，Western blot和qRT-PCR显示STMN1蛋白及mRNA显著升高，肿瘤球数量显著增加，SOX2、NANOG、OCT4、CD44蛋白和mRNA亦显著升高。结论为STMN1表达与肺腺癌细胞干性状态正相关，可能参与干性维持。
3.9 NELFE–STMN1轴促进肺癌细胞干性相关表型：通过在A549和PC-9细胞中建立STMN1敲低和过表达模型，Western blot证实效率；STMN1过表达增加CD47、Nanog、OCT4、SOX2表达，敲低则降低；在STMN1过表达细胞中给予NELFE抑制剂NELFE-In可减弱上述上调。结论为NELFE参与STMN1介导的肺癌细胞干性维持，支持NELFE–STMN1轴的调控作用。

讨论部分总结：ALC-MSE为疾病进展至晚期的危重临床表现，肿瘤负荷增加、治疗反应下降且预后差。该研究结合单细胞转录组、多维干性评估和细胞通讯分析，识别出ALC-MSE中高STMN1表达的高干性恶性上皮细胞群，提示炎症信号失调、干性增强和微环境通讯网络重塑可能共同参与重症肺癌发生发展。随着从早期向晚期及ALC-MSE进展，恶性上皮细胞比例和总体干性评分升高；炎症/免疫通路持续下调而细胞周期、DNA复制和DNA损伤修复激活，提示晚期肺癌并非持续炎症增强，而可能呈炎症反应减弱、免疫调节失衡和持续增殖优势的生物学状态。CytoTRACE和拟时序分析证实恶性上皮细胞存在显著干性异质性，Cluster 3干性最高并位于拟时序起始State 4，Cluster 0富集于晚期且炎症信号活跃；疾病进展呈从炎症活跃状态向高干性未分化状态富集的趋势。State 4特异基因富集氧化磷酸化、TCA循环、线粒体自噬、内质网蛋白加工和铁死亡，提示高干性细胞兼具代谢适应和应激耐受。STMN1被鉴定为调控ALC-MSE细胞高干性的核心因子，编码微管解聚蛋白，既往与细胞周期、增殖和转移相关，其高表达与肺癌不良预后相关；体外肿瘤球诱导后STMN1上调，SCENIC提示NELFE、POLR2A和RAD21可能共同参与STMN1相关转录程序。STMN1+恶性上皮细胞与成纤维细胞的ECM重塑/黏附信号减弱，而MIF-CD74/CD44等干性相关信号增强；补体激活、抗原呈递和髓系免疫识别相关分子（C3、ANXA1、MHC-II相关分子）在STMN1+细胞中广泛缺失或显著减弱；STMN1?细胞（包括Cluster 0和8）主要位于中间分化阶段并具较强炎症反应和免疫互作，终末恶性状态则炎症信号减弱、干性信号占优，STMN1+细胞可能代表“低免疫互作–高干性维持”的过渡终点。局限性包括：单细胞分析主要基于公开数据且ALC-MSE样本有限，需更大独立临床队列验证；STMN1操作后虽改变核心干性标志物，但尚缺乏STMN1干预后肿瘤球形成的直接功能验证，不能确定其维持自我更新能力；细胞通讯尤其MIF–CD74/CD44为计算预测，仍需配体/受体阻断、条件培养基或共培养、空间验证和体内研究确认。

研究结论部分翻译：总之，本研究揭示了ALC-MSE中存在以高STMN1表达为特征的高干性恶性上皮细胞群，其形成可能伴随炎症信号抑制、代谢适应增强和微环境通讯重塑。STMN1不仅是晚期肺癌干性状态的重要生物标志物，也可能作为连接肿瘤干性与微环境重塑的关键调控节点，为理解ALC-MSE的分子机制和开发干性靶向治疗策略提供新的理论基础。