超声辅助低共熔溶剂提取刀豆（Canavalia gladiata (Jacq.) DC.）荚多糖CGPs?1的响应面优化、结构表征及抗氧化-降糖-抗神经炎症活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Response Surface Optimization of Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction of Bioactive Polysaccharides From Sword Bean (Canavalia gladiata (Jacq.) DC.) Pods

　　

安全且具有功能性的天然活性成分是慢性疾病早期干预研究的热点。本研究聚焦于刀豆（Canavalia gladiata (Jacq.) DC.）荚来源的多糖（CGPs?1）。其最佳超声辅助提取条件为：氯化胆碱/草酸低共熔溶剂（DES；由氢键受体与供体经氢键作用形成的绿色溶剂）比例为2:1、含水量34%、液固比21 mL/g、65°C、280 W下29 min；实际得率（33.24%）与预测值（33.96%）一致。CGPs?1被鉴定为吡喃型多糖，由鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）和半乳糖醛酸（GalA）组成，摩尔比为1.08:1:1.78。CGPs?1对α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）、α-淀粉酶（α-amylase）、DPPH自由基和ABTS自由基的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.157 mg/mL、0.083 mg/mL、31.18 mg/mL和2.264 mg/mL，可抑制脂多糖（LPS）触发的炎症反应及LPS介导的BV2（小鼠小胶质细胞系）细胞神经毒性，并抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的斑马鱼幼鱼炎症反应。结果表明，CGPs?1具有抗氧化、降糖、抗神经炎症和神经保护潜力，为进一步研究和开发源自刀豆荚的功能性食品相关产品提供了初步实验支持。

研究背景与问题：神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）以进行性神经元丢失为特征，机制复杂且临床干预有限；全球老龄化和现代生活方式使脑健康维护需求增加，安全且具功能性的天然活性成分成为慢性疾病早期干预研究热点。高血糖、氧化应激和神经炎症相互关联并形成恶性循环：慢性高血糖可通过线粒体功能障碍和多元醇通路激活诱导过量活性氧（ROS）和持续氧化应激，过量ROS激活核因子κB（NF-κB）及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体信号，触发小胶质细胞活化及促炎因子分泌，加重中枢神经炎症；持续神经炎症又削弱内源性抗氧化防御并加重神经元氧化损伤，升高认知障碍和神经功能障碍风险。植物多糖因降糖、抗氧化和抗炎等特性被认为有早期干预潜力，但许多植物来源多糖资源尚未开发。刀豆（Canavalia gladiata (Jacq.) DC.）既是蔬菜又是传统民间中药，历史用于缓解炎症、癌症、便秘、鼻窦炎和化脓性疾病，但机制未充分阐明；既往药理研究多关注粗提物抗哮喘、抗炎、抗过敏、抗脂肪生成和成骨等，植物化学研究多集中于单宁、凝集素、多酚、萜类和黄酮等非多糖成分，鲜少关注刀豆多糖组分。常规热水提取耗时长、溶剂消耗大、效率低且高温可能破坏热敏多糖；微波辅助提取可能局部过热并破坏多糖骨架；酶法受试剂成本高和最佳反应条件窗口窄限制；超临界CO₂提取仪器昂贵且对极性多糖溶解度差。超声辅助提取依靠超声空化在较温和条件下破坏植物细胞壁，缩短处理时间并降低多糖热分解风险，但水基溶剂仍存在提取时间长、活性成分损失、效率低和溶剂消耗大等问题。DES具有高提取效率、环境友好和较强增溶能力，少量水可降低黏度、改善传质并便于后续分离。为此，研究人员建立超声辅助DES提取刀豆多糖（CGPs）流程，优化提取条件，研究基础结构特征并初步评价降糖、抗氧化和抗神经炎症活性，为刀豆来源多糖的后续应用提供实验参考。研究结果显示CGPs?1具抗氧化、降糖、抗神经炎症和神经保护潜力，为刀豆荚功能食品相关产品开发提供初步实验支持，但仍需哺乳动物体内验证、精细结构解析和机制研究。

关键技术方法：刀豆荚干燥切段购自线上供应商（Liuxiang Xiancang），商品标示产地湖南，中国，接收后经形态学验证。关键方法包括：超声辅助DES提取；单因素结合Box-Behnken设计（BBD）响应面优化；DEAE-Sepharose（阴离子交换层析介质）与Sephadex G-75（葡聚糖凝胶过滤介质）纯化；高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测分子量、高效液相色谱（HPLC）测单糖组成、傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征；α-葡萄糖苷酶/α-淀粉酶抑制、DPPH/ABTS清除、LPS诱导BV2细胞炎症及N2a（小鼠神经母细胞瘤来源神经元样细胞系）条件培养基神经毒性实验；MPTP诱导Tg(mpeg1:EGFP)（表达增强绿色荧光蛋白的巨噬细胞/小胶质细胞报告）斑马鱼脑炎症模型。

研究结果：
2.1 DESs Screening：通过固定水含量30%、液固比20 mL/g、280 W、30 min、65°C，比较7种以氯化胆碱（ChCl）为氢键受体（HBA）的DES。得率由高到低为羧酸类（OA、MA、CA）>酰胺类（尿素）>多元醇类（Gly、BDO、EG），ChCl-草酸（OA）2:1最高，故选为后续溶剂。
2.2 Single Factor Experiments：逐一考察DES水含量、DES摩尔比、温度、超声功率、超声时间和液固比。得率随各因素先升后降，最优为水含量30%、ChCl-OA 2:1、65°C、280 W、30 min、20 mL/g；作者指出顺序单因素可能路径依赖，故进一步采用响应面法进行多变量优化。
2.3 Response Surface Experiments：以水含量（A）、液固比（B）、超声时间（C）和超声功率（D）进行BBD 29次试验；模型R²=0.9829、C.V.%=6.16，模型显著、失拟不显著；因素影响顺序为A>C>D>B；A、AC、BD、A²、C²、D²显著。预测最优为液固比21.1527 mL/g、水含量33.9375%、超声时间28.5648 min、功率280.233 W，预测得率33.9604%；修正为21 mL/g、34%、29 min、280 W，实际得率33.2435%，与预测一致；同条件超声辅助水提仅28.67%。
2.4 Analysis of Gradual Purification：粗CGPs经DEAE-Sepharose在0～0.8 M NaCl梯度洗脱得酸性多糖，再经Sephadex G-75得单一对称峰CGPs?1；纯度93.75%，粗样78.94%，提示两步纯化提高纯度并适合后续表征。
2.5 Molecular Weight Determination：HPGPC显示CGPs?1为单一主峰，重均分子量（M_w）为274.063 kDa，提示分子量均一性较好。
2.6 Analysis of Monosaccharide Components：HPLC显示CGPs?1由Rha、GlcA和GalA组成，摩尔比1.08:1:1.78；GalA占比最高，且富含糖醛酸。
2.7 Analysis of FTIR：FTIR在3415 cm^?1（O—H伸缩）、2827 cm^?1（C—H伸缩）、1615 cm^?1（羰基不对称伸缩）、1351 cm^?1（C—H角变形）、1055 cm^?1（C—O伸缩，吡喃糖特征）和774 cm^?1（C—H面外弯曲）有特征峰；提示CGPs?1为吡喃型酸性多糖；精确主链需甲基化和NMR分析。
2.8 In-Vitro Hypoglycemic-Related Activity：α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制均呈浓度依赖，IC₅₀分别为0.157和0.083 mg/mL；按质量浓度弱于阿卡波糖，对α-淀粉酶抑制更强；与文献多糖比较显示中等α-葡萄糖苷酶抑制、强于GFP。
2.9 In-Vitro Antioxidant Activity：DPPH^•（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）和ABTS^•+（2,2'-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）清除呈浓度依赖，IC₅₀分别为31.18和2.264 mg/mL；弱于维生素C（VitC）；对ABTS^•+更有效；与BPL-2趋势一致；糖醛酸是ABTS抗氧化核心贡献，DPPH活性受溶剂兼容和分子构象共同调控。
2.10 Inhibitory Activity on Inflammation in LPS-Induced BV2 Cells：以2、5、10 μg/mL CGPs?1预孵BV2细胞2 h，再用1 μg/mL LPS刺激24 h；CCK-8显示无细胞毒；CGPs?1浓度依赖抑制一氧化氮（NO）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）分泌；LPS处理条件培养基（L-CM）降低N2a细胞活力，而CGPs?1预条件培养基恢复活力，提示可逆转小胶质细胞炎症介质所致神经毒性。
2.11 Inhibitory Activity on Brain Inflammation in Zebrafish：用Tg(mpeg1:EGFP)斑马鱼，MPTP诱导脑炎症，地塞米松（DXM）为阳性对照；结果部分报道CGPs?1在0.1、0.2、0.4 μg/mL下炎症抑制率分别为30.2%、59.37%、70.12%，DXM为70.12%；荧光强度较模型组显著降低，提示CGPs?1抑制MPTP诱导的脑炎症。讨论认为细胞与斑马鱼结果一致；幼鱼血脑屏障未成熟对大分子通透，且CGPs?1可能通过抑制系统循环促炎介质间接减轻脑炎症，与细胞抗炎结果一致。

讨论部分总结：讨论将CGPs?1的抗氧化、降糖和抗神经炎症表型相联系，并强调体外细胞与斑马鱼整体模型结果一致，提示其可在细胞和整体水平减轻炎症介导的神经元损伤；对斑马鱼幼鱼可见中枢保护效应给出两点解释，即血脑屏障未成熟对大分子通透性较高，以及CGPs?1可能通过抑制系统循环促炎介质间接减轻脑炎症。讨论还涉及与文献多糖活性比较、糖醛酸对ABTS抗氧化贡献及DPPH活性受溶剂兼容和构象影响；同时指出结构表征仍属初步，需甲基化/NMR，缺乏哺乳动物体内证据，抗神经炎症精确机制未明。

研究结论翻译：本研究采用超声辅助DES法从刀豆荚获得均一多糖CGPs?1。最佳提取条件为：ChCl-OA（2:1）DES、DES含水量34%、液固比21 mL/g、温度65°C、超声时间29 min、超声功率280 W。在此条件下，实际多糖得率达33.24%，接近预测值33.96%，且远高于同条件超声辅助水提的28.67%。纯化后的CGPs?1为吡喃型多糖，由鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）和半乳糖醛酸（GalA）组成，摩尔比为1.08:1:1.78。生物测定显示其抗氧化潜力：DPPH^•自由基清除IC₅₀为31.18 mg/mL，ABTS^•+自由基清除IC₅₀为2.264 mg/mL；并显示降糖相关潜力：抑制α-葡萄糖苷酶（IC₅₀：0.157 mg/mL）和α-淀粉酶（IC₅₀：0.083 mg/mL）。此外，研究人员的发现表明，CGPs?1不仅能抑制LPS触发的炎症反应及BV2细胞中LPS介导的神经毒性，还能抑制斑马鱼幼鱼中MPTP诱导的炎症反应。这些发现表明，CGPs?1具有抗氧化、降糖、抗神经炎症和神经保护潜力，可能有助于干预高血糖、氧化应激和神经炎症相关神经退行性过程。本研究为进一步研究和开发源自刀豆荚的功能性食品相关产品提供了初步实验支持。然而，目前对CGPs?1的认识仍不完整：缺乏哺乳动物体内证据，其结构表征仍属初步，抗神经炎症作用的精确机制仍不清楚。因此，未来工作应开展CGPs?1生物活性的哺乳动物体内验证，完成精细结构分析以解释其构效关系，并阐明其抗神经炎症作用的机制。