土耳其药用植物酶抑制与抗氧化活性的比较研究及黑桑（Morus nigra）提取物的LC-MS/MS成分解析

《Chemistry & Biodiversity》：Comparative Enzyme Inhibitory and Antioxidant Activities of Selected Turkish Medicinal Plants With LC-MS/MS Profiling of Morus nigra Extract

研究人员通过体外实验考察了来自土耳其的八种药用植物的酶抑制活性与抗氧化活性。对提取物进行了针对α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）、α-淀粉酶（α-amylase）、胰脂肪酶（pancreatic lipase）及胰胆固醇酯酶（pancreatic cholesterol esterase）的抑制效果评估，同时采用DPPH自由基清除、金属螯合及铁还原力测定法评价其抗氧化性能。在受试样中，黑桑（Morus nigra）提取物表现出最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性（半数抑制浓度IC₅₀ = 43.34 ± 1.76 μg/mL），并对胰脂肪酶和α-淀粉酶呈现中等程度的抑制效果。对黑桑80%乙醇提取物进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，鉴定出22种酚类化合物，其中奎宁酸（quinic acid）为主要成分，其次为异槲皮苷（isoquercitrin）和绿原酸（chlorogenic acid）。所观察到的生物活性可能归因于上述酚类化合物的协同作用。这些研究结果表明，黑桑可作为一种具有潜力的天然酚类化合物来源，对与代谢性疾病相关的酶具有潜在的抑制活性。

一、研究背景与研究意义

糖尿病是一种以持续性高血糖为特征的慢性代谢疾病，其发病机制涉及胰岛素分泌缺陷、胰岛素作用障碍或两者兼有。肥胖作为全球范围内日益严重的公共健康问题，其伴随的代谢紊乱显著增加了2型糖尿病的发病风险。氧化应激被公认为糖尿病并发症发生与进展的重要促进因素，持续性高血糖导致活性氧过量产生，当内源性抗氧化防御机制不足以有效中和这些活性分子时，便造成氧化损伤。此外，脂代谢紊乱在糖尿病患者中普遍存在，被视为冠状动脉疾病的重要危险因素。因此，通过抑制参与代谢性疾病发病过程的关键酶——包括糖尿病相关的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶、肥胖相关的胰脂肪酶以及高脂血症相关的胰胆固醇酯酶——成为颇具前景的药物干预策略。药用植物作为具有抗氧化与酶抑制活性的生物活性化合物的宝贵来源，为开发针对糖尿病、肥胖及脂代谢紊乱的新型治疗药物提供了重要潜力。

尽管黑桑（Morus nigra L.）的植物化学成分与生物活性已有研究报道，但多数研究仅聚焦于特定生物学效应或单一植物材料。采用整合性方法对多种药用植物进行代谢酶抑制、抗氧化能力、总酚与总黄酮含量测定及基于LC-MS/MS的植物化学表征的比较研究仍较为有限。特别是，黑桑酚类组成与其对碳水化合物及脂质代谢酶潜在抑制活性之间的关联有待深入探究。基于上述背景，本研究对土耳其传统使用的八种药用植物进行了酶抑制与抗氧化活性的比较评价，并根据比较筛选结果，对表现出最强α-葡萄糖苷酶抑制活性及显著胰脂肪酶抑制活性的黑桑进行了详细的LC-MS/MS植物化学表征。这一将比较生物学筛选与靶向植物化学分析相结合的研究流程，为理解黑桑酚类组成与其生物活性之间的关联提供了新的见解，构成本研究的主要学术贡献。

二、研究内容与主要结论

研究人员选取隶属于七个不同科属的八种药用植物——紫花苜蓿（Medicago sativa subsp. sativa L.）、西班牙刺菜蓟（Scolymus hispanicus L.）、伊苏里卡琉璃草（Onosma isaurica Boiss. & Heldr.）、黑桑（Morus nigra）、欧洲窃衣（Torilis arvensis (Huds.) Link subsp. arvensis）、多花毛蕊花（Verbascum myrianthum Boiss.）、蠡实（Xeranthemum inapertum (L.) Mill.）及柠檬（Citrus limonum (L.) Osbeck）——以80%乙醇制备提取物，系统评价了其α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶及胰胆固醇酯酶抑制活性，以及金属螯合能力、铁还原力与DPPH自由基清除能力等抗氧化特性，同时测定了提取物的总酚与总黄酮含量。研究结果表明，黑桑提取物表现出最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC₅₀ = 43.34 ± 1.76 μg/mL），对胰脂肪酶和α-淀粉酶具有中等抑制效果，同时具有最高的总黄酮含量和金属螯合能力。基于其综合优越的生物活性，研究人员对黑桑提取物进行了LC-MS/MS植物化学表征，鉴定出22种酚类化合物，其中奎宁酸（11.904 mg/g）含量最高，其次为异槲皮苷（10.373 mg/g）、绿原酸（9.164 mg/g）、芸香苷（7.158 mg/g）和橙皮苷（4.200 mg/g）。研究认为，黑桑的生物活性可能源于多种酚类组分的联合贡献，而非单一化合物的作用。值得注意的是，黑桑的总酚含量（41.01 mg GAE/g提取物）并非最高，但其总黄酮含量（65.44 mg QE/g提取物）位居首位，表明生物活性不仅取决于总酚含量，更与特定生物活性黄酮的定性组成及相对丰度密切相关。斯皮尔曼等级相关分析显示，总酚含量与铁还原抗氧化能力呈强正相关（ρ = 0.905, p = 0.005），DPPH自由基清除活性与铁还原抗氧化能力呈正相关（ρ = 0.810, p = 0.022），但植物化学含量与酶抑制活性之间未发现显著相关性（p > 0.05），提示酶抑制作用并不仅仅与酚类化合物总量相关，可能还取决于各组分的定性组成、结构特征及其与酶靶标的相互作用。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：以80%乙醇通过室温浸渍法对八种药用植物进行提取；采用Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量，以三氯化铝比色法测定总黄酮含量；运用DPPH自由基清除实验、金属螯合能力测定及铁还原力实验三种体外模型综合评价抗氧化活性；分别建立α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶及胰胆固醇酯酶四种酶抑制活性测定体系；采用配备电喷雾离子源的超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）系统，在多反应监测（MRM）模式下对黑桑提取物中53种植物化学化合物进行定量分析。植物材料于2021年7月采自土耳其不同地区，凭证标本保藏于加济大学标本馆，其中黑桑采用叶和果实混合提取。

四、主要研究结果

（一）提取率、总酚及总黄酮含量

八种植物提取物的提取率介于柠檬的13.65%（w/w）最高值至其余各样品的较低水平之间。总酚含量范围为23.09 ± 1.68至99.01 ± 2.53 mg GAE/g提取物，以蠡实提取物含量最高（99.01 ± 2.53 mg GAE/g）。总黄酮含量范围为17.65 ± 0.82至65.44 ± 2.50 mg QE/g提取物，黑桑提取物含量最高（65.44 ± 2.50 mg QE/g）。文献检索表明，蠡实的总酚含量此前尚无研究报道。

（二）抗氧化活性

在2 mg/mL高浓度下，各样品的DPPH自由基清除能力为53.66 ± 3.14%至89.00 ± 0.52%。欧洲窃衣提取物的清除率（89.00 ± 0.52%）最接近阳性对照抗坏血酸（93.43 ± 0.15%）。金属螯合能力方面（2 mg/mL），各样品范围为45.31 ± 5.01%至91.31 ± 4.75%，黑桑提取物表现出最强的金属螯合能力，接近阳性对照EDTA（100.00 ± 0.00%）。铁还原力实验中，各提取物的吸光度值为0.38 ± 0.00至2.74 ± 0.08，蠡实提取物具有最高的吸光度，但均远低于阳性对照槲皮素（3.62 ± 0.05）。

（三）酶抑制活性

在200 μg/mL浓度下，各样品的α-葡萄糖苷酶抑制率为40.65 ± 2.17%至100%。紫花苜蓿达到完全抑制，但以IC₅₀值衡量，黑桑具有最低的IC₅₀值（43.34 ± 1.76 μg/mL），显著优于其他受试样品，阳性对照阿卡波糖的IC₅₀为0.07 ± 0.01 μg/mL。α-淀粉酶抑制实验中，所有提取物的抑制活性均较弱（17.06 ± 1.75%至49.49 ± 0.62%），IC₅₀值均大于200 μg/mL，柠檬提取物表现出相对最强的α-淀粉酶抑制效果。胰脂肪酶抑制实验中，除黑桑外（38.08 ± 3.81%），其余物种均未观察到抑制活性。胰胆固醇酯酶抑制实验中，除欧洲窃衣外的所有物种均有抑制效果，以蠡实提取物的抑制作用最强（51.46 ± 5.31%，IC₅₀ = 184.45 ± 2.33 μg/mL），阳性对照辛伐他汀的IC₅₀为51.03 ± 2.12 μg/mL。

（四）LC-MS/MS植物化学表征

在检测的53种化合物中，黑桑80%乙醇提取物中有22种得到鉴定并定量。含量最高的为奎宁酸（11.904 mg/g），其次为异槲皮苷（10.373 mg/g）、绿原酸（9.164 mg/g）、芸香苷（7.158 mg/g）和橙皮苷（4.200 mg/g）。其他重要化合物包括紫云英苷（2.882 mg/g）、烟花苷（2.131 mg/g）、富马酸（1.526 mg/g）和原儿茶酸（1.100 mg/g）。含量较低的组分包括芹菜素（0.185 mg/g）、木犀草素（0.128 mg/g）等。与文献报道的先前研究（如Vukmirovi?等对黑桑不同部位提取物的HPLC分析）相比，本研究的植物化学谱在主要化合物的种类与含量上存在一定差异，研究认为这些差异受植物生长环境、发育阶段、采收时间与方法以及提取条件等因素的显著影响。

五、讨论与结论总结

讨论部分的核心观点在于，LC-MS/MS表征所揭示的酚类组分与观察到的酶抑制活性之间存在良好的一致性。奎宁酸已被报道能抑制α-葡萄糖苷酶（IC₅₀ = 5.46 mM）并作为α-淀粉酶的竞争性抑制剂，同时也是有效的胰脂肪酶抑制剂（IC₅₀ = 13 μM）。异槲皮苷对α-葡萄糖苷酶具有显著抑制活性，可延缓餐后高血糖。绿原酸及其亲脂性衍生物可通过混合型机制同时抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶。研究认为，黑桑中高含量的奎宁酸、绿原酸、异槲皮苷等酚类组分可能是其α-葡萄糖苷酶抑制活性的物质基础，而黄酮类化合物如芸香苷、木犀草素、芹菜素衍生物等可能通过与酶结合区域相互作用而协同贡献于整体酶抑制活性。尽管未进行分子对接研究，已有计算研究支持这些化合物参与酶-配体相互作用。研究强调，植物提取物的健康促进作用可能源于复杂基质中结构多样的植物化学物质的加合与互补效应，而非单一化合物单独作用的结果。从制药开发的角度来看，本研究提供的全面LC-MS/MS表征为提取物标准化奠定了分析基础，奎宁酸、异槲皮苷、绿原酸、芸香苷、橙皮苷、紫云英苷和烟花苷等主要酚类成分可作为提取物质量控制与标准化的潜在化学标记物。

六、研究结论翻译

本研究表明，来自土耳其植物区系的多种药用植物提取物具有显著的酶抑制和抗氧化活性。在受试物种中，黑桑叶与果实的混合提取物表现出最强的综合生物活性。该提取物对α-葡萄糖苷酶具有特别强的抑制作用，并对胰脂肪酶和α-淀粉酶呈现中等活性，提示其可能影响与代谢性疾病相关的关键酶通路。LC-MS/MS植物化学分析揭示了多样的酚类谱，奎宁酸被鉴定为主要成分，同时伴有异槲皮苷、芸香苷和绿原酸等黄酮类化合物。所观察到的生物活性很可能源于这些酚类化合物的联合贡献，而非单一化合物单独作用的结果。总体而言，这些发现为支持植物来源酚类化合物在酶抑制策略中的重要意义提供了不断积累的证据。然而，这些体外结果的生物学意义仍需进一步阐明，尤其需要开展体内及机制性研究以深入理解其潜在治疗意义。