《Marine Pollution Bulletin》：A validated Nile Red fluorescence method following KOH/H?O? digestion for microplastic detection in marine molluscs
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一种经验证的基于KOH/H2O2消化的尼罗红荧光法用于海洋软体动物微塑料检测
摘要：尼罗红染料（Nile Red dye，NRD）染色能够实现微塑料（microplastics，MP）的快速筛选，但其可靠性高度依赖于有机质的有效去除。本研究验证了一种半自动化的
一种经验证的基于KOH/H2O2消化的尼罗红荧光法用于海洋软体动物微塑料检测
摘要：尼罗红染料（Nile Red dye，NRD）染色能够实现微塑料（microplastics，MP）的快速筛选，但其可靠性高度依赖于有机质的有效去除。本研究验证了一种半自动化的NRD荧光方法，该方法结合两步KOH/H2O2消化协议，用于生物组织中的MP鉴定。研究人员评估了消化过程去除有机物的效率，考察了其对合成及天然参比材料荧光响应与完整性的影响，并在来自保加利亚黑海沿岸的紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）和脉红螺（Rapana venosa）样本上对该工作流程进行了验证。结果表明，两步消化法从海洋软体动物组织中去除了超过99.8%的有机物。消化后，合成聚合物与天然材料的尼罗红荧光强度比值提高了16.9倍。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，处理后合成聚合物的化学完整性得以保持，其谱图匹配质量指数（Hit Quality Index，HQI）范围为89.7%至99.3%。该工作流程在两种目标物种中成功应用，证实了其作为标准化、高通量MP监测方法的潜力。
论文解读：基于KOH/H2O2消化的尼罗红荧光法用于海洋软体动物微塑料检测的方法验证
研究背景与目的
微塑料在水生生态系统中的广泛分布引发了严重的环境关切。这些颗粒物来源于大块塑料垃圾的碎裂、车辆轮胎磨损、建筑活动、个人护理产品中的微珠以及合成纺织纤维等多种途径。被生物摄入后，微塑料可能导致物理损伤、氧化应激、炎症反应，并通过食物网传递化学物质。传统的基于视觉检查的鉴定方法错误率高且易受操作者主观偏差影响。基于傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FTIR）和拉曼光谱的光谱技术虽然精确，但耗时且昂贵，限制了其在大规模监测项目中的应用。公众和机构的高度关注催生了对快速、标准化、成本效益高的分析方法的需求，这对于实施《海洋战略框架指令》（Marine Strategy Framework Directive，MSFD）的描述符10至关重要。
尼罗红染料（Nile Red dye，NRD）染色相比传统光谱学能实现更快速的筛查，并且与半自动化成像工作流程兼容。然而，其可靠性高度依赖于有机质的有效消化。不充分的降解会留下与塑料产生相似荧光的生物残留物，增加假阳性结果的风险。反之，过于剧烈的处理可能降解或改变聚合物颗粒，导致假阴性结果。因此，在高效去除有机物与保持聚合物完整性之间取得平衡仍是一项重大挑战。氢氧化钾（potassium hydroxide，KOH）因其对常见聚合物的高效性和低影响而被广泛用于动物组织降解。然而，碱性消化通常无法去除纤维素和几丁质等非蛋白质物质，这些物质在使用NRD时会贡献背景荧光，增加假阳性的可能性。因此，研究人员提出了采用过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）的两步氧化处理，以提高合成与天然颗粒之间的荧光区分度。尽管测试日益广泛，但在试剂浓度、孵育条件和处理时长方面仍存在优化空白。为了确保有效的有机物去除并同时保持聚合物完整性以供NRD检测及后续光谱确认，可重复的工作流程仍然不可或缺。
滤食性双壳类动物极易摄入微塑料，是监测水生塑料污染的理想模式生物。黑海中的腹足类动物脉红螺（Rapana venosa）是紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）的主要捕食者，使得这一物种对非常适合用于验证消化方案和研究营养级转移。
本研究的目的是验证一种用于生物组织中微塑料鉴定的半自动化NRD荧光方法，该方法采用两步KOH/H2O2消化协议。具体而言，研究人员评估了消化过程去除有机物的有效性，考察了其对合成及天然参比材料荧光响应和完整性的影响，并在来自保加利亚黑海沿岸采集的M. galloprovincialis和R. venosa样本上对该工作流程进行了验证。
主要关键技术方法
- 1.
样品处理与组织消化流程：采用两步消化法。第一步使用10% KOH溶液进行碱性消化，第二步使用30% H2O2在超声浴中进行氧化处理。NRD溶于丙酮后在孵育的最后30分钟加入。消化后的溶液通过金属或Whatman Anodisc 25滤膜过滤，以备后续μ-FTIR分析。
- 2.
微塑料检测与成像系统：使用半自动化系统进行滤膜成像，该系统包括一个CNC 3018 Pro机器底座用于精确的三轴移动、一个470 nm蓝色LED环形灯和一个黄色带通滤光片。图像由Olympus EP50相机配合Hayear HY-D120X镜头拍摄。粒子数量、形状和尺寸使用开源的Python应用程序Microplastic Annotation Package进行量化。
- 3.
化学完整性评估：使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）评估合成聚合物在消化前后的化学完整性。光谱保存程度通过谱图匹配质量指数（Hit Quality Index，HQI）量化，定义为L2归一化光谱间的绝对皮尔逊相关系数，以百分比表示。
- 4.
样本来源：用于验证工作流程的生物样本——紫贻贝（M. galloprovincialis）和脉红螺（R. venosa）采集自保加利亚黑海沿岸。
研究结果
3.1. 加标材料的荧光特性
研究人员制备了六种合成聚合物和六种天然材料各三个独立阳性对照，评估了它们在原始状态和消化后的荧光特征，以识别潜在的荧光颜色、强度和外观变化。
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3.1.1. 重量分析协议与降解计算：通过精密分析天平称量每种参比材料1.00 ± 0.05 mg，经过消化流程后，通过干燥和称重确定最终净重量损失。净材料降解通过总损失减去转移损失计算得出，以排除机械操作损耗。
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3.1.2. 荧光强度量化：使用ImageJ软件测量荧光强度、颜色和外观变化。通过“滚动球”算法扣除不均匀背景照明后，测量积分密度（Integrated Density，IntDen）。消化后的荧光强度变化百分比通过公式计算。同时，使用ImageJ取色器工具和Python代码计算每个滤膜上10个随机荧光颗粒的中位HEX色码，以确定荧光颜色。
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3.1.3. FTIR结构与成像验证：使用ATR-FTIR光谱评估合成聚合物在消化前后的化学完整性。将每种合成聚合物1 mg加入到真实M. galloprovincialis样品中。光谱记录范围为4000至600 cm-1，分辨率为4 cm-1。光谱保存程度通过HQI量化。结果显示，所有合成聚合物的HQI值范围在89.7%至99.3%之间，表明其化学结构在消化后得到良好保持。
3.2. 应用于野外采集样本
研究人员将该验证后的工作流程应用于从保加利亚黑海沿岸采集的M. galloprovincialis和R. venosa样本。对于每个物种，处理了六个程序空白以评估背景污染。通过半自动化成像系统捕获滤膜图像，并使用Microplastic Annotation Package软件进行粒子计数、形状和尺寸分类。形状根据圆形度指数自动分为纤维、碎片或颗粒。研究结果证实了该工作流程在实际环境样本中的适用性。
讨论与结论
讨论总结：
该研究验证的两步KOH/H2O2消化法在去除海洋软体动物组织有机质方面表现出极高的效率（>99.8%），显著优于单一KOH消化，后者会留下导致背景荧光的残留物。消化后，合成与天然材料之间的尼罗红荧光强度比提升了16.9倍，这极大地增强了NRD方法区分微塑料与天然有机物的能力，从而降低了假阳性率。同时，FTIR分析证实，该温和的消化条件并未损害合成聚合物的化学完整性（HQI 89.7–99.3%），确保了后续光谱确认的准确性。该工作流程在半自动化成像系统的辅助下，实现了高通量的样品处理，并结合开源软件进行客观的粒子分类，提高了结果的重复性和可比性。通过在黑海两种代表性物种上的成功应用，证明了该方法的实际可行性和生态监测价值，尤其适用于大规模、标准化的微塑料污染监测计划，例如为MSFD的实施提供技术支持。然而，研究人员也指出，对于某些特定聚合物或极端条件下的样品，仍需进一步优化以确保方法的普适性。
研究结论翻译：
本研究的目的是验证一种用于生物组织中微塑料鉴定的半自动化NRD荧光方法，该方法采用两步KOH/H2O2消化协议。通过对合成和天然参比材料的系统评估以及对野外采集样本的应用，研究人员得出结论：该两步消化法能够高效去除海洋软体动物组织中的有机质（>99.8%），同时保持合成聚合物的化学完整性（FTIR HQI: 89.7–99.3%）。消化后，合成与天然材料之间的NRD荧光比值显著提高（16.9倍），有效减少了假阳性风险。该工作流程在M. galloprovincialis和R. venosa上的成功验证，表明其作为一种可靠、高通量且标准化的方法，在海洋微塑料污染监测中具有重要的应用前景。
