《Chemistry & Biodiversity》：Molecular Targets and Potential Mechanisms of Luteolin Against Cervical Carcinoma: Integrative Approach Combining Network Pharmacology, Molecular Docking, Molecular Dynamics Simulations, and In Vitro Validation
编辑推荐：
宫颈癌（cervical carcinoma）在妇科恶性肿瘤中发病率与死亡率均位居前列，亟需开发新型治疗策略。网络药理学、分子动力学模拟及细胞生物学方法的整合为揭示天然活性成分及其分子机制提供了有效途径。橄榄（olive）含有多种具有抗氧化及抗肿瘤活性的生物活
宫颈癌（cervical carcinoma）在妇科恶性肿瘤中发病率与死亡率均位居前列，亟需开发新型治疗策略。网络药理学、分子动力学模拟及细胞生物学方法的整合为揭示天然活性成分及其分子机制提供了有效途径。橄榄（olive）含有多种具有抗氧化及抗肿瘤活性的生物活性成分，其中木犀草素（luteolin）作为主要天然黄酮类化合物之一，已被证实具有显著的抗肿瘤活性。本研究鉴定出C-X-C趋化因子配体8（C-X-C chemokine Ligand 8，CXCL8）为与宫颈癌进展相关的关键靶点，并发现木犀草素与CXCL8存在强且稳定的相互作用，可显著下调其在HeLa细胞中的表达。同时，木犀草素能够显著抑制HeLa细胞的增殖、迁移及脂滴形成能力。上述结果表明，来源于橄榄的木犀草素可能通过调控CXCL8抑制HeLa细胞，为橄榄来源生物活性成分在宫颈癌抗肿瘤治疗中的应用提供了理论基础。
木犀草素靶向CXCL8抑制宫颈癌的机制研究：网络药理学、分子动力学模拟与体外实验的整合解读
一、研究背景与问题提出
宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在女性癌症中均居第四位，高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是其首要致病因素。尽管疫苗接种、早期筛查和放射治疗等常规手段不断进步，患者预后仍不理想，许多患者在治疗后出现耐药、严重不良反应及疾病复发。宫颈癌的复杂性涉及多条遗传和分子通路，单一靶点治疗策略难以有效控制疾病进展，因此探索多靶点调控策略以获得有效且安全的治疗方案日益迫切。
橄榄因其丰富的生物活性和健康益处受到广泛关注，作为酚类化合物的天然宝库，其含有多种具有强抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用的生物活性分子。流行病学证据表明，食用橄榄可降低代谢紊乱和某些癌症的风险。木犀草素作为橄榄中主要的天然黄酮类功能化合物之一，已被证实具有广泛的药理潜力，可通过调控氧化应激、炎症和细胞增殖相关通路抑制肿瘤转移。然而，木犀草素在宫颈癌中的确切作用机制仍需进一步阐明。
此外，炎症趋化因子在癌症发生发展中的关键作用日益受到重视。CXCL8（又称白细胞介素-8，interleukin-8）是一种促炎细胞因子，通过激活其受体促进血管生成和肿瘤侵袭。在结直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中，CXCL8的高表达已被频繁报道并与不良预后相关。已有证据表明木犀草素可降低炎症或癌组织中的CXCL8表达，提示该黄酮类化合物与CXCL8信号通路之间存在潜在相互作用。然而，CXCL8在宫颈癌中是否异常表达及其具体调控机制仍不清楚。因此，本研究整合网络药理学、分子动力学模拟和细胞生物学方法，旨在阐明木犀草素调控CXCL8在宫颈癌中的作用机制。
二、主要技术方法
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取GSE64217数据集（包含2例正常宫颈黏膜样本和4例宫颈鳞状细胞癌样本，平台为GPL10558），通过差异表达基因（DEGs）分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以及基于GEPIA数据库的预后和表达分析，筛选关键调控靶点。利用PubChem和PDB数据库获取木犀草素和CXCL8（1IL8）的结构，通过AutoDockTools进行分子对接，采用GROMACS软件进行100 ns的分子动力学模拟，评估复合物的稳定性。最后通过MTT实验、细胞划痕实验、集落形成实验、尼罗红染色、qRT-PCR和Western blot等细胞生物学实验进行体外验证。
三、研究结果
3.1 橄榄中天然生物活性化合物的鉴定
研究人员对GSE64217数据集进行可行性评估，主成分分析（PCA）显示疾病组与对照组之间存在明显分离，标准化箱线图确认各样本间具有良好的一致性。火山图和热图可视化结果显示共检测到2300个DEGs（筛选条件为校正p < 0.05且|LogFC|>1）。橄榄来源的23种化合物与GSE64217数据集之间鉴定出70个共同靶点，并构建了"靶点-疾病-天然化合物"相互作用网络。GO功能聚类分析显示，橄榄相关靶点在生物学过程（BP）中富集于"低氧应答"，在细胞组分（CC）中富集于"染色体区域"，在分子功能（MF）中富集于"丝氨酸型内肽酶活性"。KEGG分析显示"NOD样受体信号通路"是宫颈癌发生发展的潜在机制。
3.2 核心基因与不良预后相关
通过CytoHubba功能识别PPI网络中的关键调控节点，前十位基因被认定为Hub基因。生存分析显示，CXCL8与不良预后显著相关（p < 0.05），森林图分析表明CXCL8在宫颈癌中具有显著的风险比（p < 0.05），在所有Hub基因中风险比最大、置信区间最广，证实其在宫颈癌中的关键作用。基于GEPIA数据库的基因表达水平箱线图显示，CXCL8、PLAU、STAT1和TXN四个与不良预后相关的关键基因在宫颈癌组中的表达水平显著高于对照组（p < 0.05）。
3.3 木犀草素与CXCL8的稳定结合
分子对接评估显示，木犀草素可与CXCL8结合，结合自由能为?7.177 kcal·mol?1，与ALA69、GLU38、GLU70和CYS9形成氢键。对接分数低于?5.0 kcal·mol?1代表木犀草素与CXCL8之间具有较强的结合能力。分子动力学模拟结果显示，CXCL8-木犀草素复合物的均方根偏差（RMSD）值维持在0.41 ± 0.04 nm，回转半径（Rg）平均值维持在1.51 ± 0.02 nm，溶剂可及表面积（SASA）平均值维持在93.67 ± 2.83 nm2，复合物在整个模拟过程中保持较高的氢键密度和键合强度，且存在多个低能稳定构象区域，表明该复合物在生理条件下具有动态稳定性。
3.4 木犀草素对HeLa细胞活力的影响
MTT实验表明，木犀草素（1.25–160 μM）以浓度依赖性方式显著抑制HeLa细胞活力。40 μM木犀草素处理后，HeLa细胞活力为对照组的63.51% ± 1.12%（p < 0.01）。以HACAT细胞作为正常对照，木犀草素在所测浓度下对HACAT细胞活力无显著影响，表明木犀草素对HeLa细胞具有特异性抑制作用。
3.5 木犀草素对HeLa细胞迁移的影响
划痕实验结果显示，与对照组相比，木犀草素处理可显著抑制HeLa细胞的迁移能力（p < 0.01），且呈剂量依赖性效应。
3.6 木犀草素对HeLa细胞集落形成的影响
集落形成实验显示，木犀草素处理组HeLa细胞集落数量较对照组显著减少（p < 0.01），呈剂量依赖性抑制。40 μM木犀草素处理后，集落数量为对照组的6.98% ± 1.29%。
3.7 木犀草素对HeLa细胞脂滴积累的影响
尼罗红染色结果显示，木犀草素处理组的脂滴积累较对照组显著减少（p < 0.01），荧光强度降至对照组的54.69% ± 5.5%，表明木犀草素可显著抑制HeLa细胞的脂滴积累。
3.8 木犀草素对HeLa细胞CXCL8表达的影响
qRT-PCR结果显示，木犀草素处理后HeLa细胞中CXCL8 mRNA水平较对照组显著降低（p < 0.01）。Western blot结果进一步证实，木犀草素处理组HeLa细胞中CXCL8蛋白表达水平较对照组显著降低（p < 0.01），且呈浓度依赖性效应。
3.9 木犀草素对HeLa细胞关键蛋白表达的影响
基于KEGG通路富集分析中CXCL8富集程度最高的NOD样受体通路，研究人员进一步检测了NLRP3、IL-1β和IL-18的表达。结果显示，40 μM木犀草素处理后，HeLa细胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的表达均显著下调，相对表达量分别为对照组的0.54 ± 0.01、0.50 ± 0.03和0.54 ± 0.03（p < 0.01），且浓度升高时表达水平逐步降低，表明木犀草素可调控HeLa细胞中的NOD样受体信号通路。
四、讨论与结论
本研究阐明了橄榄来源木犀草素在宫颈癌中的潜在作用机制，确定CXCL8为核心靶点。生存分析显示CXCL8与宫颈癌不良预后显著相关，与既往在肝细胞癌、乳腺癌和卵巢癌中的研究结果一致。分子对接和分子动力学模拟证实木犀草素与CXCL8存在稳定结合，且不改变蛋白质整体构象。体外实验表明，木犀草素在相对较低浓度（40 μM）下即可有效抑制HeLa细胞的活力、迁移、集落形成和脂滴积累，且对正常HACAT细胞无显著细胞毒性。在分子水平上，木犀草素以浓度依赖性方式显著抑制CXCL8的表达，同时下调NLRP3、IL-1β和IL-18的表达，提示木犀草素通过抑制NLRP3/IL-1β/CXCL8轴调控炎症性肿瘤微环境。
综上所述，本研究证明木犀草素可直接结合CXCL8，并通过调控NOD样受体信号通路抑制宫颈癌进展。木犀草素在HeLa细胞中降低了细胞活力、迁移、集落形成和脂滴积累，下调CXCL8表达，并抑制NLRP3、IL-1β和IL-18的表达。这些结果表明木犀草素通过调控CXCL8介导的通路发挥抗肿瘤作用。与既往研究相比，本研究为木犀草素的抗肿瘤效应提供了更全面的机制解释和实验验证，有望推动更多研究者进一步在动物模型和临床样本中验证这些发现，并探索其药代动力学、安全性特征及联合治疗策略。
