《Materials Today Bio》：Clinical Validation of a Vial Wall-based Dielectric Barrier Discharge Plasma Activation Device for Plasma-Activated Platelet-Rich Plasma Preparation in Osteoarthritis Pain Management
编辑推荐：
冷大气等离子体（Cold atmospheric plasma, CAP）因其能够在环境条件下产生局部电场及富含活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）、活性氮物种（reactive nitrogen species, RNS）、
冷大气等离子体（Cold atmospheric plasma, CAP）因其能够在环境条件下产生局部电场及富含活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）、活性氮物种（reactive nitrogen species, RNS）、电子和离子的理化环境，作为一种针对骨关节炎（osteoarthritis, OA）和牙周炎等疾病的生物物理干预手段而受到广泛关注。然而，CAP在生物组织中的穿透深度有限，这促使其发展为可注射的等离子体激活液体产品，以将CAP的治疗范围扩展至关节腔等深部解剖部位。大多数关于等离子体激活装置的实验研究采用开放式操作设计，如等离子体喷枪或放电室，目标液体样品通过与等离子体源直接接触而被激活。尽管这些方法在探索性研究中易于实施，但其开放式设计本质上与临床制备所要求的无菌性、标准化和质量控制不相容。富血小板血浆（platelet-rich plasma, PRP）疗法为基于CAP的激活提供了一个可满足明确未满足需求的临床场景。但临床结果仍存在差异，血小板激活不足导致生长因子释放不完全是造成这种不一致的潜在因素。本文报道的装置设计基于一项审慎的工程决策，即重新利用现有临床设备作为功能性装置组件。标准临床采血管具有高介电强度、圆柱对称性、密封性和预灭菌特性，这些特性直接对应DBD等离子体发生所需的介质阻挡要求。研究人员设计并构建了一种全封闭、非接触式的等离子体激活原型机，其中采血管壁作为整体介质阻挡层，研究人员将其称为基于管壁的DBD等离子体激活系统。在该配置中，高压电极和接地电极位于外部并适配于管壁，等离子体在密封管内的液体顶部空间产生，而无需物理破坏容器。密封管内的液体通过管壁被等离子体场激活，从而在整个过程中保持样品的原始无菌性。该设计消除了传统等离子体激活流程中开放式样品处理的需求，简化了制备过程，并提供了不依赖操作者技术的标准化参数激活。研究人员通过技术表征、配对PRP检测、细胞实验、小鼠OA模型和人OA软骨外植体实验以及一项探索性split-body临床研究对该装置进行了评估。使用该装置产生的等离子体激活PRP（plasma-activated PRP, PA-PRP）与血小板活化、高浓度生长因子和巨噬细胞标志物变化相关。药理学ROS清除减弱了PA-PRP相关的巨噬细胞标志物变化，支持ROS参与其中，但未鉴定出具体的反应物种或下游通路。临床部分评估了三名患者，旨在评估操作可行性并为未来一项效能充分的随机试验生成假设。
**论文解读文章**：
**一、研究背景与问题**
冷大气等离子体（Cold atmospheric plasma, CAP）作为一种生物物理干预手段，因能产生局部电场及富集活性氧物种（reactive oxygen species, ROS）、活性氮物种（reactive nitrogen species, RNS）等活性成分，在骨关节炎（osteoarthritis, OA）等疾病治疗中展现潜力。然而，CAP在生物组织中穿透深度有限，制约其直接临床应用。为此，可注射的等离子体激活液体产品被开发以扩大治疗范围。现有实验室研究多采用开放式等离子体装置，如等离子体喷枪，样品与等离子体直接接触，虽便于探索性研究，但其开放性无法满足临床制备所需的严格无菌、标准化和质控要求。另一方面，富血小板血浆（platelet-rich plasma, PRP）疗法广泛用于OA疼痛管理，但临床结果存在变异，血小板激活不足所致生长因子释放不完全是重要因素。因此，开发一种标准化、无污染且符合注射用无菌标准的PRP激活方法具有重要意义。
**二、研究目的与开展的研究**
针对上述问题，研究人员利用标准临床采血管的管壁作为天然介质阻挡层，设计了基于管壁的介质阻挡放电（vial wall-based dielectric barrier discharge, DBD）等离子体激活装置，在密封管内实现PRP的非接触式激活，全程保持样品无菌，并免除开放式操作的污染风险。研究人员对该装置进行了系统评估，涵盖装置电气特性表征、参数优化、稳定性与污染风险评估、血小板活化与生长因子释放检测、细胞与动物模型验证、人软骨外植体实验，以及一项三患者探索性split-body临床研究。
**三、主要关键技术方法**
研究人员运用了多项关键技术：设计并组装管壁式DBD反应器，利用采血管壁作为介质阻挡层实现密封管内放电；采用示波器和Lissajous图形进行电气特性表征；使用商业化ROS检测试剂盒和电子顺磁共振（electron paramagnetic resonance, EPR）波谱法进行活性物种分析；通过免疫荧光染色检测血小板活化标志物CD63；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和细胞因子芯片定量生长因子；利用小鼠内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus, DMM）手术建立OA模型；采用步态分析评估功能恢复；利用人OA软骨外植体进行离体培养；临床部分为随机、单盲、split-body设计，涉及3例双侧膝OA患者，样本来源于南方医科大学珠江医院（伦理批准号2026-KY-202-01）。
**四、研究结果**
**1. 利用医用采血管作为介质阻挡层实现密封管等离子体激活**
研究人员构建了管壁式DBD等离子体激活系统，在3 W最小维持功率下，密封管内PRP液面上方产生蓝色丝状放电。示波器测得峰值输出电压约6.08 kV、电流约7.45 mA、频率10 kHz，输出功率1.58 ± 0.18 W，放电效率52.57% ± 6.05%。不同品牌采血管均可实现稳定放电，产生合格PA-PRP。
**2. 可控可重复激活条件与污染风险降低**
通过调节输入功率、占空比和激活时长，可精确控制产物温度、pH和ROS浓度。优化参数窗口为：输入功率6 W、占空比1%、激活时长15 s，产物温度≤37°C、pH维持7.2–7.4。连续激活50个样品，ROS浓度变异系数仅4.53%。与常规开放式等离子体激活相比，密封管激活的PA-PRP未见细菌、真菌及厌氧菌菌落，内毒素低于检测限，显著降低污染风险。
**3. 装置成功制备PA-PRP**
人PRP经优化参数激活后，43.04% ± 9.67%的CD41阳性血小板表达活化标志物CD63，显著高于未激活PRP。ELISA显示TGF-β、总PDGF和IGF-1浓度显著升高。细胞因子芯片检测到PDGF-BB、DBP、VEGF、IL-10、IGFBP-2、IGFBP-3、IL-1Ra、PDGF-AA、IL-4等因子不同程度升高。巨噬细胞培养中，PA-PRP降低M1标志物iNOS表达并升高M2标志物CD206和ARG1表达，NAC可部分逆转此变化；软骨细胞表型与功能得到正向维持。
**4. PA-PRP改善OA小鼠步态并减轻关节软骨损伤**
DMM模型小鼠经PA-PRP治疗后，步幅长度、后肢步幅宽度和足旋转角等步态参数较OA组和PRP组显著改善，综合步态恢复指数高于PRP组（97.69% ± 1.36%对比86.35% ± 4.35%）。OARSI病理评分显示PA-PRP组软骨退变评分显著低于OA组和PRP组，基质金属蛋白酶9（MMP9）水平显著降低，MMP3和MMP13亦有下降趋势。
**5. PA-PRP在人OA软骨外植体中显示更高基质染色信号**
人OA软骨外植体培养14天后，PA-PRP处理的软骨番红O染色和阿尔辛蓝染色强度均显著高于PRP和对照组，提示PA-PRP可能具有软骨保护活性。
**6. 轻中度膝OA患者的探索性临床观察**
3例双侧轻中度膝OA患者接受随机单盲split-body治疗后，第15周PA-PRP治疗膝在VAS疼痛评分、WOMAC总分和积液抽取量方面的描述性平均改善幅度均大于PRP对侧膝，无不良事件记录。该结果为描述性观察，未进行推断性统计学检验。
**7. PA-PRP短期生物相容性与安全性**
体外软骨细胞和巨噬细胞存活率在对照组、PRP组和PA-PRP组间无显著差异。10周小鼠实验中各组小鼠全部存活、体重增长无明显差异，主要脏器组织学未见明显病理异常。3例患者注射部位及全身均未见不良反应。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，该管壁式DBD装置通过采血管壁作为介质阻挡层，实现了电气稳定性（功率效率约52%）、批量重复性（ROS浓度CV 4.53%）和不同品牌耗材的兼容性。密封管激活显著降低了需氧菌、真核微生物、厌氧菌和内毒素污染风险，对关节腔注射具有重要安全意义。优化参数窗口（6 W、1%占空比、15 s）确保了产物温度≤37°C、pH在生理范围内。虽然研究观察到血小板活化、生长因子释放和巨噬细胞标志物改变，并支持ROS参与的机制假说，但未能鉴定具体活性物种及下游信号通路，未来需结合物种分辨表征、选择性清除剂、通路抑制剂及巨噬细胞耗竭实验进行因果验证。动物实验中小样本量限制了效应估计精度；临床部分仅3例患者，为概念验证性质，结果应视为可行性观察而非疗效证据；研究未与氯化钙或凝血酶等化学激活方法进行头对头比较；最终PRP产品的血小板回收率、白细胞组成等未系统定量。工程方面，当前原型机成本约4000美元，未来集成一体化和实时ROS传感闭环控制有望降低成本并提升临床适用性。结论指出，该装置值得在效能充分、标准化PRP表征和更长随访的试验中进一步评估。
