BVDV-1 Npro 序列中影响自动蛋白酶活性以及抑制干扰素-β合成的关键氨基酸（半胱氨酸和组氨酸）

《Microbial Pathogenesis》：The key amino acids (cysteine and histidine) across BVDV-1 Npro sequence that affect autoprotease activity and inhibition of IFN-β synthesis

　　

• •
  保守的半胱氨酸和组氨酸残基对于BVDV-1的N^pro自蛋白酶活性至关重要。
• •
  BVDV-1 N^pro中的His40、His99、Cys112、Cys134和Cys138与自蛋白酶活性和干扰素拮抗作用均存在密切关系。
• •
  半胱氨酸和组氨酸的同义密码子替换无法影响BVDV-1 N^pro的活性。
• •
  BVDV-1 N^pro的自蛋白酶活性和IFN-β抑制作用仅能部分分离，这与半胱氨酸和组氨酸位点的突变有关。

引言

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是黄病毒科（Flaviviridae） pestivirus属（Pestivirus）的重要成员。该属包括多种具有重要经济价值的动物病原体，如BVDV 1型（BVDV-1）、BVDV 2型（BVDV-2）、经典猪瘟病毒（CSFV）和边界病病毒（BDV）^[1]。BVDV作为一种强效免疫抑制性病原体，对全球畜牧养殖业构成了严重威胁。病毒基因组由约12.5 kb的单股正义RNA组成。病毒RNA进入宿主细胞后，被翻译为单一的多聚蛋白，随后经病毒和宿主蛋白酶加工为四种结构蛋白（衣壳蛋白、E^rns、E1、E2）和八种非结构蛋白（N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）^[2]。N^pro是一种仅存在于Pestivirus属中的独特病毒蛋白。与黄病毒科其他属成员——如黄病毒属（Flavivirus，例如西尼罗河病毒和登革病毒）或丙型肝炎病毒属（Hepacivirus，例如丙型肝炎病毒）——不同，N^pro由168个氨基酸组成，被鉴定为一种负责自身切割的半胱氨酸蛋白酶，可自催化新生多聚蛋白的切割以产生衣壳蛋白[3], [4]。目前已公认Cys69和His49作为蛋白酶活性中心的两个位点，在Cys168与Ser169之间肽键的自切割中发挥重要作用^[5]。BVDV N^pro的自切割作用是病毒多聚蛋白加工的第一步，并启动病毒复制周期[4], [6]。

干扰素是抗病毒防御的第一道防线，在宿主模式识别受体识别病毒成分后被迅速诱导^[7]。除了自切割活性外，BVDV N^pro还参与抑制宿主抗病毒反应，有助于病毒的有效复制[8], [9]。在病毒生命周期中，从多聚蛋白释放的N^pro特异性靶向宿主转录因子干扰素调节因子3（IRF3），促进其泛素化，随后通过蛋白酶体途径进行降解，从而有效阻断IFN-α/β的诱导并破坏先天免疫信号通路。鉴于N^pro与自切割和干扰素抑制相关的双重功能，它是BVDV毒力的关键决定因素[8], [10], [11], [12]。越来越多的证据表明，与干扰素抑制相关的N^pro依赖于某些关键残基，如N末端区域的Leu8、Glu22和His49，以及C末端锌结合TRASH结构域中的Cys112-X21-Cys134-X3-Cys138基序[13], [14], [15]。此前的报告指出，Cys112Ala、Cys134Ala、Cys138Ala或Asp136Asn等单残基替换可破坏锌配位，并部分损害与IRF3和IRF7的相互作用[5], [16], [17], [18]。

BVDV基因组通常维持较高水平的遗传变异性以增强病毒适应性^[19]。就BVDV N^pro编码序列的遗传变异性而言，多样化的核苷酸对、同义密码子及密码子邻近核苷酸上下文可能为BVDV突变株提供充足的适应性提升机会，从而克服宿主的强效免疫防御[20], [21], [22]。在遗传变异性方面，导致氨基酸改变的核苷酸替换被归类为非同义替换，而不改变编码氨基酸的核苷酸替换则被归类为同义替换。这两种类型的核苷酸替换可能对基因功能和进化过程产生不同的影响。尽管BVDV N^pro是一种具有自催化活性的半胱氨酸酶，并不直接参与病毒复制^[3]，但该蛋白酶在干扰素抑制和诱导持续性感染的发展中发挥重要作用^[23]。与BVDV N^pro从多聚蛋白自催化相关的自切割速率可能影响其对干扰素合成的抑制作用。因此，鉴定在N^pro自催化活性中发挥重要作用的关键残基，可为深入了解N^pro导致干扰素抑制的机制提供新的见解。此前的报告指出，IRF3降解和自蛋白酶活性是CSFV N^pro的两个独立但结构上重叠的功能，因为N^pro中的两个突变可以消除N^pro介导的IRF3降解而不影响自蛋白酶活性^[15]。然而，BVDV N^pro中对自蛋白酶活性至关重要的关键残基是否也影响N^pro介导的干扰素抑制作用仍有待阐明。已公认两种典型氨基酸（组氨酸和半胱氨酸）主导了BVDV N^pro的自蛋白酶活性[3], [4], [24]。一个假设是：BVDV-1 N^pro编码序列中的两种典型氨基酸（组氨酸和半胱氨酸）影响N^pro的自蛋白酶活性和介导的干扰素抑制作用。为验证该假设，我们比对来自不同BVDV-1毒株的N^pro氨基酸序列，以鉴定N^pro中半胱氨酸和组氨酸残基的保守分布。随后，我们采用定点突变技术来评估特定的半胱氨酸和组氨酸残基对BVDV-1 N^pro两种生物学功能的影响。

章节摘要

细胞与质粒

HEK293细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；兰州民海生物工程有限公司）的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM；兰州百灵生物科技有限公司）中培养，培养条件为37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱。质粒pCMV-C-Flag、pET-28a-GFP和Poly(I:C)保存在本实验室。

BVDV-1 N^pro遗传特征分析

从GenBank通过美国国立

BVDV-1 N^pro中半胱氨酸和组氨酸残基的高度保守性

根据N^pro序列比对结果，氨基酸替换在该区域更为普遍，在所有残基中有41.1%存在替换。dN/dS分析显示出了BVDV-1 N^pro明确的进化模式。在所检验的所有N^pro编码序列中，dS值（1.24 ± 0.53）始终高于dN值（0.07 ± 0.02）（p < 0.05），表明同义替换显著多于非同义替换。相应地，BVDV-1 N

讨论

作为BVDV的主要毒力因子，N^pro从病毒多聚蛋白中自蛋白水解切割，随后参与抑制IFN-β的诱导。在BVDV基因组进化过程中，N^pro编码区域受到显著序列变异的影响，涉及同义和非同义替换[20], [21], [22]。一个关键问题是BVDV-1 N^pro关键位点上的同义或非同义替换是否会损害其自蛋白酶

结论

总之，本研究系统调查了保守的半胱氨酸和组氨酸残基在BVDV-1 N^pro生物学功能中的作用，重点关注自蛋白酶活性和IFN-β抑制。我们的结果表明，包括His40、His49、His99、Cys69、Cys112、Cys134和Cys138在内的多个高度保守残基对于维持N^pro的反式作用自蛋白酶活性至关重要，而半胱氨酸和组氨酸残基的同义密码子替换

CRediT作者贡献声明

Tong Wang：撰写——审阅与编辑。Xiaoxia Ma：监督、项目管理、资金获取。Xiao-ting Ren：撰写——初稿、调查、形式化分析、概念构思。Ju-shuang Hong：形式化分析、数据整理。Le-le An：可视化、数据整理

伦理声明

本研究不涉及动物实验，因此无需伦理审批。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性财务利益或可能影响本文所述工作的个人关系。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在本文及科学数据银行中获取：10.57760/sciencedb.38867。

伦理声明

本研究不涉及动物实验，因此无需伦理审批。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性财务利益或可能影响本文所述工作的个人关系。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在本文及科学数据银行中获取：10.57760/sciencedb.38867。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性财务利益或可能影响本文所述工作的个人关系。

致谢

本研究由国家自然科学基金（编号：32360874）、甘肃省自然科学基金（编号：23JRRA715）、西北民族大学学科建设基金项目以及西北民族大学人才引进基金基础研究资金（编号：xbmuyjrc202225）资助。

Xiao-ting Ren|Ju-shuang Hong|Le-le An|Tong Wang|Xiaoxia Ma