生物素修饰的基于BODIPY的光动力疗法技术与实时电化学监测技术相结合，在纳米纤维支持的肺癌细胞实验平台上进行应用

《Microchemical Journal》：Biotin-functionalized BODIPY-based photodynamic treatment integrated with real-time electrochemical monitoring in a nanofiber-supported lung cancer cell platform

　　

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  生物素化的BODIPY能够保留¹O₂的生成并增强细胞的PDT活性。
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  A549细胞显示出的BOD-Bio-Fl荧光和PDT反应比WI-38更强。
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  PVDF–PEI纳米纤维结合了细胞支持功能和基于CAT的H₂O₂传感。
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  PVDF–PEI/CAT传感器在PB中的浓度范围为1–75?μM，在DMEM/F12中的浓度范围为0.5–25?μM时具有线性响应。
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  智能手机控制的LED照射与实时安培测量相结合。

引言

光动力疗法（PDT）结合了光敏剂（PS）、适当波长的光和分子氧来生成细胞毒性活性氧（ROS）。由于其空间和时间可控性，PDT已成为局部癌症治疗的一种有吸引力的方法；然而，其治疗效果在很大程度上取决于PS的光化学性质、细胞积累以及细胞对照射的生物学反应[1]。硼二吡咯甲烯（BODIPY）衍生物作为光敏剂支架具有很大的潜力，因为它们具有強的可见光吸收能力、光稳定性和合成可调性。特别是，BODIPY核心的碘化可以通过重原子效应促进系间窜越，从而增强单线态氧（¹O₂）的生成[2]，[3]。同时，生物素偶联被研究作为一种策略，通过生物素相关的摄取系统促进治疗分子的细胞积累，这些系统的表达在不同细胞类型中可能有所不同[4]，[5]，[6]。这些分子设计策略为改进基于BODIPY的光敏剂的细胞递送和光动力性能提供了机会。

除了光敏剂的设计外，用于评估PDT的生物模型也极大地影响了治疗反应数据的相关性。传统的二维培养仅能有限地反映天然组织中遇到的结构和细胞-基质相互作用，这促使了支持性支架和微工程细胞模型的发展[7]，[8]。静电纺丝纳米纤维（ESNFs）因其相互连接的纤维结构和高表面积而特别适合这一目的，它们为细胞附着和生物分子固定提供了有利的界面。因此，基于明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）、聚-L-乳酸（PLA）和聚己内酯（PCL）等材料的静电纺丝支架已被探索用于多种组织工程应用[9]，[10]，[11]，而其他纳米纤维材料也被整合到生物标志物检测和细胞氧化应激监测的传感平台上[12]，[13]，[14]。在这些材料中，聚（乙烯idine fluoride）（PVDF）提供了一种机械稳定的纳米纤维支撑，而聚乙烯亚胺（PEI）由于其丰富的表面胺基团，在适当控制的浓度下可以改善表面功能并促进生物活性分子的固定[15]，[16]。因此，PVDF–PEI纳米纤维提供了多功能、高表面积的界面，既支持细胞附着，又可以实现用于电化学检测的酶功能化。

传统PDT评估的另一个限制是主要依赖终点测量，包括细胞活力测定和荧光成像。尽管这些方法对于确定总体治疗结果很有价值，但它们提供的关于照射过程中或照射后立即发生的生化变化的信息非常有限。对于II型光敏剂来说，短寿命的¹O₂是引发氧化损伤的主要初级光化学物种。然而，随后的细胞损伤和氧化还原平衡的破坏可能会改变寿命较长的ROS相关物种（如过氧化氢（H₂O₂）的水平。因此，H₂O₂不应被视为初级¹O₂生成的直接定量替代物；相反，由于其较高的稳定性，它成为分析与PDT相关的下游生化变化的分析指标[17]，[18]，[19]。电化学传感器非常适合监测此类变化，因为它们可以在细胞系统中提供快速、实时的测量[20]，[21]，[22]，[23]。过氧化氢酶（CAT）能够选择性地催化H₂O₂的分解，特别适用于构建酶响应型电化学界面。因此，将CAT固定在高表面积的PVDF–PEI纳米纤维上可以将支持细胞的支架与电化学响应层结合起来，用于监测细胞外的H₂O₂相关变化。

尽管人们对先进的体外PDT模型越来越感兴趣，但将光动力治疗与实时电化学监测相结合的研究仍然有限。以前的芯片PDT研究主要集中在通过终点活力或基于成像的测量来评估治疗效果，而电化学细胞平台通常只监测个别参数，如氧气消耗或ROS相关代谢物，而没有在同一实验框架内整合光敏剂设计、纳米纤维支持的细胞界面和照射后的电化学监测。例如，Marzioch等人将计时安培氧气传感整合到乳腺癌模型中，并展示了PDT后细胞氧气消耗的变化[21]。使用5-氨基乙酸的肺癌微平台研究也展示了在工程化细胞环境中评估PDT的可行性，但主要通过终点测量来评估治疗反应[24]，[25]。同时，基于纳米纤维的电化学系统已经显示出监测细胞氧化应激的能力[14]，但尚未专门设计用于将靶向的BODIPY基光动力治疗与实时监测细胞反应相结合。因此，PDT微平台、纳米纤维支持的细胞模型和电化学监测策略各自被单独或部分组合地探索过；然而，它们的功能集成以比较癌细胞和非癌细胞的反应并在获得关于PDT相关细胞外氧化还原变化的实时信息方面仍然相对较少。

因此，在本研究中，制备了生物素化的荧光和光动力活性的BODIPY衍生物，以研究其在A549肺癌腺癌细胞和WI-38非癌性成纤维细胞中的细胞积累和光动力反应。进一步比较了生物素化光敏剂与其相应非生物素化衍生物在A549细胞和WI-38非癌性成纤维细胞中的光动力活性，以评估生物素化对观察到的细胞反应的影响。使用PVDF–PEI静电纺丝纳米纤维界面作为细胞支持基底和CAT在丝印碳电极上的固定表面。在控制LED照射后，通过实时安培测量监测与PDT相关的细胞外H₂O₂变化，补充了传统的光动力活性终点评估。通过将光敏剂设计、纳米纤维支持的细胞培养、控制光照和实时电化学传感整合在一个共同的实验框架内，所提出的平台提供了一种补充方法，用于研究超出传统终点测量的细胞依赖性光动力反应。

章节片段

实验部分

材料、探针合成和表征、纳米纤维制备、CAT固定、细胞培养、光动力处理、设备制备、电化学测量和统计分析的详细描述见支持信息（ESI）。

支架和表征

通过扫描电子显微镜（SEM）、能量分散X射线光谱（EDX）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和接触角测量，对纯PVDF、PVDF–PEI和PVDF–PEI/CAT静电纺丝纳米纤维进行了检查。SEM图像和纤维直径分布显示，纯PVDF形成了较厚的纤维，且尺寸分布较宽（图1A?–A??）。PEI的加入导致平均直径减小和分布变窄。

结论

本研究建立了一个基于纳米纤维的细胞平台，将生物素化的BODIPY基光动力治疗与实时电化学监测相结合。生物素偶联保持了光敏剂的单线态氧生成效率，而荧光成像和游离生物素竞争实验支持了生物素相关细胞相互作用对观察到的光动力反应的贡献。BOD-Bio-PDT产生了更明显的光动力效果

作者贡献声明

Ecem Saygili：撰写——原始草案、方法学、研究、形式分析、数据管理、概念化。Asli Eldem：撰写——原始草案、方法学、研究、形式分析、数据管理。Sultan Sacide Gelen：撰写——原始草案、方法学、研究、形式分析、数据管理。Yunus Emre Ersoy：方法学、形式分析、数据管理。Resul Tahtaci：方法学、形式分析、数据管理。Ece Bayir：方法学、形式分析、数据

[30]，[31]

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

作者感谢土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK）2218 国家博士后研究奖学金计划在Grant No. 123C175下的资助。

Ecem Saygili|Asli Eldem|Sultan Sacide Gelen|Yunus Emre Ersoy|Resul Tahtaci|Ece Bayir|Mehmet Ihsan Hekimhan|Dilek Odaci|Muhammed Ucuncu