基于稳定同位素的印度蜂蜜鉴定：元素分析仪与液相色谱-同位素比质谱联用技术的综合真实性标准评价

《Microchemical Journal》：Stable isotope-based authentication of Indian Honey using elemental Analyzer and liquid chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry: Comprehensive evaluation of authenticity criteria

　　

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  使用EA/LC-IRMS和LC-IRMS测定了65个印度蜂蜜样本的碳稳定同位素比值。
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  结合EA-IRMS和LC-IRMS标准检测掺假的效果优于仅使用EA-IRMS。
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  约39%的已知来源样本和51%的商业样本未通过真实性标准。
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  蜂蜜、葡萄糖和果糖的δ¹³C值之间存在显著相关性。
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  研究结果支持FSSAI蜂蜜真实性标准，并凸显了消费者安全的重要性。

引言

根据国际食品法典标准（1981）[1]，蜂蜜是蜜蜂利用植物花蜜或吸食植物汁液的昆虫排泄物（在植物的活体部分采集）而制造的一种天然甜味物质。这些物质被采集并在蜂体内通过与蜜蜂自身分泌的特有物质结合而发生转化，随后被存入蜂巢，经过脱水、储存和成熟。在此过程中，水分从约30–60%降至15–19%，同时转化酶将蔗糖转化为更简单的糖类，主要是葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶产生少量的过氧化氢和酸性物质，有助于蜂蜜的稳定性。随后蜂蜜在开放的蜂巢格中继续成熟，直至达到所需的稠度，之后蜜蜂用蜡封住蜂房[2]。蜂蜜的主要成分包括糖类，如果糖（30–45%）、葡萄糖（22–41%）和蔗糖（0.25–7.6%）。蜂蜜已知的营养和药用价值包括抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病和促进伤口愈合等[3]、[4]、[5]、[6]。这些优势增加了市场对蜂蜜的需求，但也使其成为掺假的对象，这是一个严重的全球性问题，已经损害了养蜂行业并使消费者健康面临风险[7]。蜂蜜真实性涉及两个方面。一方面是内容真实性，即必须是100%纯蜂蜜，不得含有任何糖糖浆。另一方面是地理和植物来源。这两个方面都是蜂蜜真实性的必要条件。

蜂蜜掺假可以直接在收获后的蜂蜜中添加外来糖，也可以间接通过给蜜蜂饲喂糖液来实现。廉价的糖浆如玉米糖浆和甘蔗糖浆常被用作蜂蜜的掺杂物[7]、[8]、[9]。理化参数的测定是传统蜂蜜掺假检测方法的基础[10]、[11]。然而，由于这些外来糖与蜂蜜中固有的糖类具有相似的糖苷结构，这些技术无法检测并定量蜂蜜中的外来糖。

目前已报道了多种通过分析不同理化参数来检测蜂蜜掺假的分析方法。这些方法包括：利用HPLC法分析蜂蜜中糖类的植物来源[12]、开发阴离子色谱法[12]、傅里叶变换红外光谱联用化学计量学方法[13]、同位素比值质谱联用化学计量学方法[14]，以及核磁共振联用统计分析来检测蜂蜜掺假[15]。此外，一些研究人员使用联用技术如串联质谱来确认某些标志物的存在（多糖、2-乙酰呋喃-3-葡萄糖苷和二呋喃糖苷，这些标志物存在于掺杂物中而不存在于天然蜂蜜中[16]。由于很难同时检测这些掺杂物中的某些物质，Du等人[17]建立了一个包含糖类糖浆标志物特异性色谱和质谱信息的小型数据库。这些方法大多需要复杂的样品前处理且非常耗时。

一种基于C3植物（蜜蜂花蜜和花粉的主要来源）与C4植物（包括常见的来自甘蔗和玉米的掺杂物）之间碳稳定同位素比值（¹³C/¹²C）差异的技术，因其在区分蜂蜜中C4糖存在方面的能力而获得了国际认可[18]、[11]、[19]、[20]、[7]、[8]。

在光合作用过程中，植物从环境中吸收CO₂时，根据植物的代谢循环类型，碳同位素会发生分馏。C4植物使用Hatch-Slack循环将CO₂转化为糖类，而C3植物使用Calvin-Benson循环。由于这些代谢过程中参与的不同酶类，C3和C4植物的¹³C/¹²C比值存在显著差异[21]。C3植物（蜜蜂花蜜和花粉的主要来源）的δ¹³C读数（即样品与维也纳Pee Dee海滩鹦鹉螺标准相比的¹³C/¹²C比值）范围为?32至?21‰，而C4植物（包括玉米和甘蔗）的范围为?19至?12‰[11]。

国际分析化学家协会联合会采用内标碳稳定同位素比值分析法（ISCIRA）作为AOAC 998.12方法[22]，用于检测蜂蜜中C4糖掺杂物的存在[18]。由于蜜蜂通常从相同的植物获取蛋白质和碳水化合物，因此整体蜂蜜的稳定碳同位素比值与其蜂蜜蛋白的比值应该是相当的。这正是ISCIRA方法的基础，该方法将整体蜂蜜的δ¹³C水平与作为内标的蜂蜜蛋白进行比较。外来C4糖会改变整体蜂蜜的δ¹³C值，但不会改变蛋白的δ¹³C值。ISCIRA指数（δ¹³C_蛋白 ? δ¹³C_整体蜂蜜）对于真实蜂蜜（即不含外来C4糖的蜂蜜）必须≥ ?1[18]。

Elflein和Raezke[23]进一步改进了EA/LC-IRMS检测蜂蜜C3/C4倒转糖浆掺假的方法。他们收集了来自全球的451个蜂蜜样本，进行了稳定同位素比值分析，并提出以下真实蜂蜜标准：Δδ¹³C_max（‰）± 2.1（所有测量的δ¹³C值之间的最大差异）；Δδ¹³C_果-葡（‰）± 1.0；以及Δδ¹³C_P-H（‰）≥ ?1。随后开发的EA/LC-IRMS方法在性能上显著优于此前方法。

2012年，土耳其蜂蜜法规采用了基于EA-IRMS的标准[24]，而基于EA/LC-IRMS的标准于2018年被纳入印度法规[25]、[26]。2024年，贸易组织批准了True Source认证标准[27]，英国标准化协会也批准了由欧洲标准化委员会发布的基于LC-IRMS的蜂蜜真实性评估方法[28]。

印度是全球第七大蜂蜜生产国和第三大出口国，作为一个拥有超过500种植物物种的生物多样性丰富的国家，为供应各类蜂蜜做出了重要贡献。

2020年，印度政府启动了"蜂蜜使命"以支持"甜蜜革命"，旨在使农民收入翻倍。2018年，印度食品安全与标准局（FSSAI）修订了蜂蜜法规，增加了基于同位素签名的检测以确保蜂蜜的真实性[26]。这些检测包括：外源寡糖（最大百分峰面积）0.7%、C4糖（质量百分比，最大7.0）、Δδ₁₃C_P-H（‰）≥ ?1.0、Δδ¹³C_Fru-Glu（‰）± 1.0，以及Δδ¹³C_max（‰）± 2.1。在本研究中，从市场和养蜂农户处收集了65个印度蜂蜜样本，以建立来自不同植物和地理来源的印度蜂蜜同位素值数据库。据文献报道，此类研究在印度开展得很少，且没有任何研究将商业/未知来源和已知来源的蜂蜜样本分为两组进行相关性分析和掺假检测。更具体地说，没有任何研究报道了市售蜂蜜的碳稳定同位素签名。

章节摘要

蜂蜜样本

商业蜂蜜样本从市场购买。样本也从全印协调研究项目（AICRP，蜜蜂和传粉昆虫）以及已知养蜂农户处收集。已知来源样本的地理来源和植物来源数据已在修订稿表2b中报告。在本研究中，我们未根据地理和植物来源对样本进行区分，表2a和2b应作为描述性而非分析性内容来阅读。

标准物质与试剂

同位素标准物质

结果与讨论

按照推荐方法[22]，使用EA-IRMS对65个印度蜂蜜样本进行了δ¹³C_H、δ¹³C_P、Δδ¹³C_P-H和C4糖的测定，以确定同位素参数。根据FSSAI推荐方法[29]，使用LC-IRMS在新德里印度农业研究院（IARI）区域蜂蜜检测设施对δ¹³C_Fru-Glu和Δδ¹³C_max值进行了分析。图1展示了糖混合标准和一份蜂蜜样本的色谱图。Δδ¹³C_max为

结论

本研究针对在印度市场、养蜂农户和全印协调研究项目（AICRP，蜜蜂和传粉昆虫）收集的65个样本（18个已知来源和47个未知来源蜂蜜样本）进行了研究，并按照基于EA/LC-IRMS的方法提供了产自印度蜂蜜的同位素特征摘要。我们使用EA/IRMS测定了蜂蜜样本及从蜂蜜中提取蛋白的δ¹³C值。除2个已知来源和8个未知来源蜂蜜外，其余蜂蜜的δ¹³C_蜂蜜值为

作者贡献声明（CRediT）

Priya Saini：撰写——初稿、调查研究。Sumit Shekhar：调查研究。Neethu Narayanan：方法论。Tirthankar Banerjee：资源。Suman Gupta：验证。K.M. Kumaranag：资源。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家养蜂委员会为建立尖端区域蜂蜜检测设施提供的财政支持。作者还对印度农业研究委员会和新德里印度农业研究院提供的技术和财政支持表示感谢。作者还对全印协调研究项目（AICRP）蜜蜂和传粉昆虫项目的

Priya Saini|Sumit Shekhar|Neethu Narayanan|Tirthankar Banerjee|Suman Gupta|K.M. Kumaranag