还原剂耐受型（3R）TfR1二聚体升高作为铁死亡的高度特异性标志物

《Nature Cell Biology》：The rise of reducing reagent-resistant TfR1 dimer marks ferroptosis

铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的细胞死亡类型，由过度膜脂质过氧化引起。检测铁死亡细胞仍具挑战，尤其是在体内（in vivo）环境中，这阻碍了转化研究。本研究中，研究人员发现转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TfR1）的还原剂耐受型（reducing reagent-resistant，3R）二聚体是脂质过氧化的高度特异性指示物。当由药理学试剂或遗传扰动诱导铁死亡时，细胞中3R二聚体水平升高。此外，3R二聚体可用于检测组织以及从小鼠或患者血浆中分离的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）中疾病相关铁死亡。鉴于TfR1几乎普遍表达，研究人员推测3R二聚体可能作为一种铁死亡标志物，在基础研究和转化研究中具有广泛潜在用途。

铁死亡（ferroptosis）是铁依赖性、非凋亡性调控细胞死亡，以多不饱和脂肪酸氧化等为特征，并可因脂质过氧化防御缺陷而增强。ACSL4（长链酰基辅酶A合成酶4）、ferritin（铁蛋白）、GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）、FSP1（铁死亡抑制蛋白1）等分别调控膜脂组成、氧化还原活性铁和脂质过氧化物解毒。培养细胞中铁死亡可通过药理学或遗传学抑制铁死亡调节因子后检测细胞死亡来操作性定义，但体内功能实验并非总能实施；脂质过氧化物及其副产物检测可作代理，却不必然特异；已有TfR1（转铁蛋白受体1）细胞表面调节、PRDX3（过氧化物还原酶3）超氧化、PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）表达等分子变化，仍缺乏高度特异且易部署的铁死亡标志物。与此相对，凋亡有caspase 3/7（半胱天冬酶3/7）剪切、坏死性凋亡有MLKL（混合谱系激酶结构域样蛋白）磷酸化、焦亡有gasdermin D/E（消皮素D/E）剪切等标志。因此，研究人员开展本研究以寻找可精确、可靠、简便评估铁死亡的分子标志物，并在体外和体内验证；该论文发表于《Nature Cell Biology》。研究人员发现TfR1的还原剂耐受型（3R）二聚体在药理学和遗传学诱导铁死亡时升高，在其他调控性细胞死亡中不升高，可作为脂质过氧化传感器，并可在细胞外囊泡（EVs）中检测。其意义在于为准确识别细胞死亡方式、细胞死亡机制研究、诊断/预后开发以及药物开发与筛选提供潜在工具。

关键技术方法包括药理学和遗传学扰动诱导或抑制铁死亡、蛋白免疫印迹（Western blot）在还原/非还原条件下检测TfR1二聚体、脂质过氧化与细胞死亡流式检测、CRISPR–Cas9（基因编辑）和shRNA（短发夹RNA）、HA（血凝素）标签TfR1及半胱氨酸突变体、免疫沉淀-无标记蛋白质组学、体外分离膜Fenton反应（芬顿反应）与双功能醛处理、EV分离与纳米颗粒跟踪分析（NTA）、铁过载多器官功能障碍综合征（MODS）小鼠模型、肝细胞特异性Gpx4^fl/fl与Alb-CreER^T2Tg/+杂交模型及UPEC（尿路致病性大肠埃希菌）尿路感染模型。患者样本来源包括正在进行的胶质母细胞瘤铁纳米颗粒（ferumoxytol，FMX）联合抗坏血酸1期临床试验（NCT04900792）治疗前后血浆，以及Washington University in St. Louis的炎症性肠病（IBD）患者血清（IRB ID#201111079；含溃疡性结肠炎和克罗恩病）。

Dimeric TfR1 is resistant to reducing reagents under ferroptosis-inducing conditions：通过药理学诱导细胞、TFRC shRNA、HA-TfR1免疫沉淀质谱、半胱氨酸突变及SDS浓度实验，研究人员在还原条件下观察到高分子量TfR1二聚体，并命名为3R二聚体；多种铁死亡诱导化合物、胱氨酸饥饿、GPX4敲除及FSP1/ACSL4相关调控均伴随3R二聚体升高，且与脂质过氧化和细胞死亡相关，可被Fer-1、Lip-1、DFO、Trolox阻断，出现早于膜破裂并在溶酶体富集。结论是3R二聚体为药理学和遗传学诱导铁死亡的稳健候选标志物。

Elevated 3R dimer levels distinguish ferroptosis from other types of cell death：通过凋亡、坏死性凋亡（TNF+z-VAD-FMK）、焦亡（LPS+nigericin）、双硫死亡（葡萄糖饥饿）、铜死亡（elesclomol）、过氧化氢（H₂O₂）、叔丁基过氧化氢（tBuOOH）、谷胱甘肽合成抑制剂（BSO）、外源柠檬酸铁铵（FAC）、MG132和tunicamycin处理，3R二聚体仅在铁死亡及tBuOOH诱导的铁死亡中升高，其他死亡和应激不诱导。结论是3R二聚体可区分铁死亡与其他细胞死亡。

Reducing reagent-resistant dimer formation is mediated by lipid-peroxidation-generated bifunctional aldehydes：通过体外分离膜硫酸亚铁（FeSO₄）驱动Fenton反应、DFO/Lip-1/Fer-1/Triton X-100处理、4CS突变、丙二醛（MDA）/4-羟基壬烯醛（4-HNE）直接处理、C353/C363和R651A突变、TfR2（转铁蛋白受体2）/NAALADL2（N-乙酰化α-连接酸性二肽酶样2）及TfR1-ST6GAL1（一种糖基转移酶）嵌合体实验，证明脂质过氧化产生的双功能醛介导3R二聚体形成，需要TfR1胞外域和预存二聚化。结论是3R二聚体为脂质过氧化传感器。

The rise in 3R dimer signal can be used to detect ferroptosis in vivo：通过铁过载MODS小鼠、Fer-1/UAMC-3203/Lip-1预处理、肝特异性Gpx4-KO小鼠和UPEC尿路感染模型，3R二聚体在肝、肾升高并与MDA相关，被铁死亡抑制剂阻断，Gpx4-KO肝中升高，UPEC焦亡模型不升高。结论是3R二聚体可用于体内检测铁死亡。

The 3R dimer is found in EVs released by ferroptotic cells in mice and in humans：通过Jurkat/THP-1细胞EV、小鼠血浆EV、胶质母细胞瘤患者FMX+抗坏血酸治疗前后血浆EV和IBD患者发作/缓解血清EV分析，3R二聚体在铁死亡细胞EV中升高，凋亡/坏死性凋亡/焦亡EV不升高；小鼠铁过载和Gpx4-KO血浆EV升高；患者治疗后及发作期EV升高，缓解后下降。结论是EV中3R二聚体可作为非侵入性铁死亡检测策略。

讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，3R二聚体在体外和体内检测铁死亡具潜在用途；在多种细胞系中药理或遗传诱导升高，脂质过氧化抑制时不累积，其他细胞死亡不诱导，组织及血浆EV可检测，临床概念验证支持其非侵入性检测多种病理中的铁死亡。局限包括交联具体氨基酸残基未明、检测依赖SDS-PAGE和免疫印迹、EV检测敏感性可能低于组织、患者间基线脂质ROS或TfR1异质性影响解读，需进一步优化。研究结论可译为：研究人员证明TfR1的3R二聚体升高在体外和体内检测铁死亡方面具有潜在用途；该升高由药理学或遗传学铁死亡诱导引起，在脂质过氧化被抑制时不累积，并可区分铁死亡与其他细胞死亡类型；组织及EV中可检测，且EV中3R二聚体有潜力作为非侵入性标志物用于不同病理的临床研究；这些数据对准确识别细胞死亡方式、细胞死亡机制研究、诊断/预后开发以及药物开发与筛选具有重要意义。