血浆cfDNA甲基化检测法MethyLiverDx-Sigma用于肝细胞癌检测的分析验证

《Molecular and Cellular Probes》：Analytical Validation of MethyLiverDx-Sigma, a Plasma cfDNA Methylation Assay for Hepatocellular Carcinoma Detection

对MethyLiverDx-Sigma（一种用于肝细胞癌检测的血浆游离细胞DNA甲基化检测法）的精密度、干扰和交叉反应进行了评估。精密度评估涵盖两个场地、两名操作人员、五个测试日和三个试剂批次。再现性的变异系数（CV）在Cq上低于2.4%，在Tm上低于0.2%，且检出率为100%。内源性或外源性物质在常规血浆水平下未产生干扰。微生物和病毒交叉反应物仅在高于常规血浆水平时才影响该检测法。

一、研究背景与目的

肝细胞癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其预后高度依赖诊断时的分期。当前针对高危人群（主要为慢性乙型或丙型肝炎感染或肝硬化患者）的监测手段是每半年一次的腹部超声检查，联合或不联合血清甲胎蛋白检测。然而，甲胎蛋白的特异性因研究人群、截断值和临床环境的不同而差异显著，且对早期肿瘤的敏感性存在公认的局限性。因此，开发一种微创、基于血液的辅助影像学监测工具具有重要的临床意义。肿瘤来源的游离细胞DNA携带肿瘤特异的表观遗传改变，而特定CpG岛区域的超甲基化在肝癌发生早期即已出现。基于此，研究人员开发了MethyLiverDx-Sigma检测法，该方法结合甲基化特异性PCR与高分辨率熔解曲线分析技术平台，旨在通过检测血浆cfDNA中的两个肝细胞癌相关甲基化靶标（RNF135和DNMT3A）来实现肝细胞癌的分子检测。本研究独立于先前报道的临床诊断性能，对该检测法进行系统的分析验证，重点评估其重复性、实验室内精密度、多场地再现性、干扰、交叉反应以及对超出预设接受限的物质进行剂量-效应表征。

二、研究方法

本研究采用替代或参考材料进行各项分析验证，未使用临床标本。研究主要涉及以下几个关键技术方法：

1. 1.
   精密度评价（遵循CLSI EP05-A3和EP12-A2指南）： 在低浓度（5倍检出限）和中浓度（50倍检出限）两个水平上，通过嵌套随机效应模型估算重复性标准差和实验室内精密度标准差，并以变异系数表示。评估涵盖单个场地、单名操作员、三个试剂批次和五个测试日。
2. 2.
   再现性评价： 在两个场地、两名操作员、五个测试日、三个试剂批次的条件下进行，共120次运行，通过方差分量估算重复性、批间、日间、操作员间、实验室内、场地间和总再现性的变异系数。
3. 3.
   干扰与交叉反应测试（遵循CLSI EP07和EP37指南）： 将待测物质掺入不含内源性人DNA的生物血浆基质中，制备模拟阴性样本和低阳性样本，使其经历从cfDNA提取开始的完整工作流程。通过计算测试条件与对照条件之间C_q和T_m的均值差异（ΔC_q和ΔT_m），并与基于再现性数据导出的接受限进行比较，判断是否存在干扰或交叉反应。
4. 4.
   剂量-效应测试（遵循CLSI EP07指南）： 对于在初始干扰或交叉反应研究中超出接受标准的物质，在模拟阴性样本中进行系列稀释测试，以确定最高无效应浓度。

三、研究结果

重复性与实验室内精密度：

所有运行均满足阳性和阴性对照有效性标准。所有三个标记物在两个浓度水平上的检出率均为100%。C_q的重复性变异系数范围为0.53%（GAPDH，中浓度）至1.68%（DNMT3A，低浓度），实验室内变异系数范围为0.80%（GAPDH，中浓度）至2.53%（GAPDH，低浓度）。T_m的所有重复性和实验室内变异系数均≤0.15%。所有值均满足预设的变异系数<10%的接受标准。低浓度样本的C_q变异性高于中浓度样本，这与低模板拷贝数下更大的随机抽样变异一致。

再现性：

所有120次运行均满足有效性标准，检出率保持100%。C_q的总再现性变异系数范围为1.10%（GAPDH，中浓度）至2.37%（GAPDH，低浓度），T_m的总再现性变异系数不超过0.20%。总再现性变异系数仅略高于相应的实验室内变异系数，表明场地和操作员带来的额外变异性较小。

干扰：

在低阳性样本中，所有18种经掺入测试的物质均满足所有三个标记物的预设ΔC_q和ΔT_m接受标准。在模拟阴性样本中，血红蛋白在初始测试浓度（1,000 mg/dL）下导致GAPDH的非特异性扩增，超出了接受标准，因此被纳入后续的剂量-效应测试。其他物质未在阴性样本中引起非特异性扩增。

交叉反应：

在低阳性样本中，所有16种微生物交叉反应物均满足所有三个标记物的接受标准。在模拟阴性样本中，SARS-CoV-2和麻疹病毒（各在1.0×10⁵ PFU/mL浓度下）引起了DNMT3A和GAPDH标记物的非特异性扩增，而RNF135未出现超限结果。非甲基化人DNA未产生任何靶标标记物的扩增。

剂量-效应表征：

血红蛋白、SARS-CoV-2和麻疹病毒这三种物质被纳入剂量-效应测试，均显示出浓度依赖性的非特异性扩增增加。

• •
  血红蛋白： GAPDH的最高无效应浓度为187.5 mg/dL（相对浓度的18.75%）。
• •
  SARS-CoV-2： 靶标标记物DNMT3A的最高无效应浓度为1.0×10³ PFU/mL（相对浓度的1%），内参GAPDH的最高无效应浓度为1.0×10² PFU/mL（相对浓度的0.1%）。综合所有检测通道的最保守值为1.0×10² PFU/mL。
• •
  麻疹病毒： DNMT3A的最高无效应浓度为1.0×10⁴ PFU/mL（相对浓度的10%），GAPDH的最高无效应浓度为1.0×10³ PFU/mL（相对浓度的1%）。综合最保守值为1.0×10³ PFU/mL。

四、讨论与结论

讨论部分总结：

本研究的特异性结果分为两种情况。在与真阳性结果相关的低阳性样本中，所有测试物质均未对C_q或T_m造成超出基于检测法自身再现性所设界限的扰动。在模拟阴性样本中，血红蛋白、SARS-CoV-2和麻疹病毒在高浓度下产生了非特异性扩增，但这种效应仅在目标阴性的样本中出现，而在低阳性样本中并未观察到，表明其主要分析学风险是在阴性样本中产生假阳性信号，而非干扰对已有低水平甲基化靶标的测量。血红蛋白的无效应浓度远高于血浆游离血红蛋白的正常参考范围上限及临床认为过高的水平。对于两种病毒，无效应浓度数值上分别约为其各自报道检测限的100倍和1000倍。此外，研究指出了若干局限性，包括使用了替代材料可能无法完全复现临床样本的异质性、精密度研究未涵盖血浆处理和cfDNA提取等全流程变异、以及定量外推PFU基无效应浓度至临床病毒载量存在限制。

结论部分翻译：

MLDx-s在低浓度（5倍预设检出限）和中浓度（50倍预设检出限）水平上均实现了100%的检出率，在两个场地、两名操作人员、五个测试日和三个试剂批次条件下，C_q的总再现性变异系数≤2.37%，T_m的总再现性变异系数≤0.20%。所有在低阳性样本中评估的18种干扰物和16种微生物交叉反应物均满足了预设的接受标准，并且剂量-效应测试确定了在阴性样本中产生非特异性扩增的物质的最高无效应浓度。由于精密度研究使用的是预先批量亚硫酸氢盐转化后的参考DNA，因此所报告的精密度估计值主要表征的是PCR-HRM检测模块，而非完整的血浆端到端工作流程；临床样本的总变异性可能还反映了血浆处理、cfDNA提取和单个样本的亚硫酸氢盐转化等因素。总体而言，这些发现表征了MLDx-s检测模块的分析精密度和多场地再现性以及该检测法的分析特异性，补充了其先前报道的临床性能，并为基于血浆的肝细胞癌分子检测提供了分析基础。