干血斑中半乳糖-1-磷酸的LC-MS/MS测定：方法特征与治疗范围

《Molecular Genetics and Metabolism》：Measurement of galactose-1-phosphate in dried blood spots by LC-MS/MS: method characteristics and therapeutic range

　　

摘要

半乳糖-1-磷酸（Gal-1-P）是经典半乳糖血症及相关疾病诊断和治疗监测的重要生物标志物。传统上在红细胞中进行测量，需要相对较大的血量且样本处理劳动密集。我们开发并验证了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于从干血斑（DBS）中定量检测Gal-1-P。分析验证包括线性、精密度、稳定性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和参考区间测定。对正在进行常规半乳糖血症监测的患者的DBS和红细胞样本进行平行分析，以比较性能特征并确定DBS特异性的治疗范围。检测限和定量限分别为0.11 mg/dL和0.17 mg/dL。参考区间确定为≤1.0 mg/dL。配对DBS和红细胞样本的比较显示出良好的相关性（R² = 0.86），DBS样本中存在约20%的负偏差。基于65例接受治疗的半乳糖血症患者的配对样本，确定了DBS治疗目标为<4 mg/dL，低于红细胞的治疗目标<5 mg/dL。通过LC-MS/MS对DBS中的Gal-1-P进行测量，为红细胞分析提供了一种临床可靠的替代方法，其优势包括所需血量更少、采集和运输更简便以及样本稳定性更好。由于相对于红细胞测量存在系统性偏差，需要确定DBS特异性的治疗范围。

引言

经典半乳糖血症由半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶（GALT；OMIM #230400）缺乏引起，是一种多系统性疾病，若不经治疗可导致严重疾病甚至死亡。限制饮食中的乳糖可有效治疗或预防急性新生儿期疾病，但即使长期饮食管理也无法阻止经典半乳糖血症的所有临床表现[1]、[2]。早期发现和开始治疗在美国和许多其他国家通过新生儿筛查得以促进。虽然GALT缺乏是最常见的半乳糖血症形式，但也有其他三种酶缺乏症同样通过限制半乳糖来治疗：半乳糖激酶（GALK；OMIM #230200）缺乏、UDP-半乳糖-4'-表异构酶（GALE；OMIM #230350）缺乏和半乳糖变位酶（GALM；OMIM #618881）缺乏。这些疾病不如GALT缺乏常见，无法通过新生儿筛查可靠识别，因此不是新生儿筛查的主要目标[3]、[4]。

GALT缺乏的诊断通过测量红细胞中的GALT酶活性确立，结合生物标志物分析，通常是红细胞半乳糖-1-磷酸（Gal-1-P）和/或尿半乳糖醇（GL），以及对GALT基因进行测序以寻找致病变异。一旦确立诊断并开始饮食治疗，Gal-1-P和GL等生物标志物会在随访就诊时进行常规监测[5]。GALE、GALK或GALM缺乏的诊断将遵循类似路径，包括酶、基因和生物标志物分析。Gal-1-P在GALE和（新生儿中的）GALM缺乏中异常，GL在GALK和GALM缺乏中异常（图1）。生物标志物测量使用各种方法。Gal-1-P水平通过气相色谱-质谱法、酶法以及最近通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在红细胞中进行监测[3]、[6]、[7]。同位素标记标准品的更广泛可获得性使LC-MS/MS测量更具可行性。此外，Gal-1-P可以使用与基于LC-MS/MS的GALT活性测定相似的进行分析的方法进行测量，其中标记的Gal-1-P是酶反应的底物[8]、[9]、[10]、[11]。

在红细胞中测量Gal-1-P的一个重大临床挑战是需要相对大量的血液以获得洗涤红细胞进行检测。从实验室方面来看，这些血液样本所需的处理过程繁琐，且不适于通过液体处理实现自动化。未经治疗的经典半乳糖血症婴儿通常具有显著升高的Gal-1-P水平。先前的工作已建立了可在干血斑（DBS）中测量Gal-1-P的方法，并证明了其整合到GALT缺乏的新生儿筛查算法中[7]。我们在此基础上进行了拓展，开发了一种使用LC-MS/MS在DBS中定量Gal-1-P的方法，按照临床实验室标准验证了该分析方法，并确立了治疗范围。该分析方法可以改善上述红细胞Gal-1-P分析中的体积要求和高效率问题。

章节摘要

试剂和设备

Gal-1-P标准品购自Sigma（MA州Burlington），同位素标记的Gal-1-P（¹³C₂）购自Omicron（IN州South Bend）。所有溶剂均为至少HPLC级别。乙腈购自Fisher Scientific（MA州Waltham），甲醇购自Supelco（PA州Bellefonte）。带有0.45 μm尼龙膜的深孔聚丙烯过滤板购自Agilent（CA州Santa Clara）。Whatman 903滤纸（MA州Marlborough）用作主要收集介质，

线性和不精密度

分析测量范围确定为0.2–62.4 mg/dL，校准曲线在31天内保持稳定。由于DBS样本中基质成分被稀释，无法进行典型的稀释实验。相反，评估了较小的1.5 mm打孔（对应3.6倍稀释因子），以实现对DBS中极高Gal-1-P的可接受性能测量。

使用低浓度（2.26 mg/dL）和高浓度

讨论

Gal-1-P是监测GALT和GALE缺乏个体中半乳糖限制的關鍵生物标志物。虽然目前的治疗选择不能完全纠正疾病表型，但它们可以挽救生命，特别是在新生儿期。建议在每位受影响个体的每次专科就诊时监测Gal-1-P水平[5]。虽然红细胞Gal-1-P是最常提供的样本类型，但它至少需要2 mL血液，这对婴儿可能存在问题，

结论

我们开发并验证了一种使用LC-MS/MS测量DBS样本中Gal-1-P的分析方法。为帮助使用该分析方法监测半乳糖血症患者的医疗保健专业人员，通过比较同一采集的DBS样本和红细胞样本中Gal-1-P的测量值，确立了治疗范围。DBS样本存在约20%的负偏差，需要为DBS样本确定单独的治疗范围：DBS为<4 mg/dL而非红细胞<5 mg/dL。

CRediT作者贡献声明

Nicholas A. Kent：验证、方法学、研究、正式分析、数据整理、概念化、写作——审阅与编辑。Mark T. Bolster：验证、方法学、研究、写作——审阅与编辑。Dietrich Matern：指导、方法学、研究、概念化、写作——审阅与编辑。Patricia L. Hall：方法学、研究、数据整理、概念化、写作——原稿撰写。Matthew J. Schultz：写作——审阅与编辑。

伦理声明

作者未获得参与者或其法定代表人的知情同意。使用的是临床检测完成后的剩余废弃物样本。

本研究按照研究所在地相关法律法规、框架和指导方针进行。本研究已获得梅奥诊所机构审查委员会批准。（批准号：26-009224）

资金来源

本研究未获得公共、商业或非营利领域资助机构的专项拨款。

利益冲突声明

作者为梅约诊所的带薪员工，在一家参考实验室工作，该实验室以按次收费的方式执行本手稿中所述检测。

Nicholas A. Kent|Mark T. Bolster|Matthew J. Schultz|Dietrich Matern|Patricia L. Hall

生化遗传实验室，实验室遗传与基因组学系，实验室医学与病理学系，梅约诊所，美国明尼苏达州罗切斯特市200 First Street SW，邮编55905