肿瘤相关肥大细胞通过CCL17/CCR4介导的调节性T细胞募集驱动肝细胞癌免疫抑制与抗PD-1治疗耐药

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Tumor-Associated Mast Cells Drive Immunosuppression and Resistance to Anti-PD-1 Therapy in Hepatocellular Carcinoma Through CCL17/CCR4-mediated Regulatory T-Cell Recruitment

　　

本研究探讨了肿瘤相关肥大细胞（tumor-associated mast cells，TAMCs）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中促进免疫抑制及抗PD-1治疗耐药的机制。研究人员检测了来自59例HCC患者的临床标本中TAMC浸润情况以及干细胞因子（stem cell factor，SCF）和多种趋化因子的水平。研究人员考察了HCC条件培养基对TAMC的募集与维持作用，重点关注SCF在此过程中的角色。此外，研究人员评估了活化TAMC分泌的CCL17对表达CCR4的调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的趋化效应，并通过检测所募集Tregs抑制CD8+ T细胞增殖及抑制细胞毒性效应分子分泌的能力，进一步评估了其功能影响。研究人员还开展了体内实验，评估抗PD-1抗体分别联合色甘酸钠（cromolyn sodium）或CCR4拮抗剂的抗肿瘤疗效。对HCC标本的分析显示TAMC显著积聚，且TAMC浸润程度与SCF及CCL17水平均呈正相关。研究人员证明HCC细胞通过分泌SCF主动募集TAMC并促进其增殖。活化后的TAMC释放CCL17，后者以CCR4依赖方式强力趋化Tregs，进而抑制CD8+ T细胞的抗肿瘤活性。在体内实验中，抗PD-1抗体联合色甘酸钠或CCR4拮抗剂产生了协同抗肿瘤效应，疗效优于任一单药治疗。总体而言，上述发现表明TAMC通过CCL17/CCR4介导的Treg募集驱动HCC中的免疫抑制，并导致抗PD-1治疗耐药。

论文解读

一、研究背景与研究意义

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在全球范围内位居恶性肿瘤发病率和死亡率前列。尽管以抗PD-1疗法为代表的免疫治疗为晚期HCC患者带来了希望，但其临床获益仍受限于较低的客观缓解率和获得性耐药。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的异常积聚是免疫抑制的重要标志，Tregs通过多种机制抑制效应性CD8⁺ T细胞的活化与功能，成为免疫检查点抑制剂疗效不佳的关键介质。肥大细胞（mast cells，MCs）作为肿瘤微环境中的免疫调节细胞，其功能日益受到关注。干细胞因子（stem cell factor，SCF）是MC存活、趋化和活化的关键介质。然而，肿瘤相关肥大细胞（tumor-associated mast cells，TAMCs）在HCC中的精确功能——尤其是其是否通过分泌特定趋化因子参与建立免疫抑制微环境并介导抗PD-1耐药——此前尚不清楚。开展这项研究的核心动因在于：深入理解HCC免疫抑制和免疫治疗耐药的驱动机制，对于制定有效的联合治疗策略、改善患者预后具有重要的临床转化价值。

二、研究概述与核心结论

该研究通过临床样本分析、体外细胞实验和体内动物模型，系统揭示了HCC细胞通过SCF-CD117轴募集并激活TAMC，活化TAMC分泌CCL17，以CCR4依赖方式募集Tregs，进而抑制CD8⁺ T细胞抗肿瘤功能，最终导致抗PD-1治疗耐药的完整机制链条。研究证实，靶向该轴的三联联合方案（抗PD-1抗体+色甘酸钠+CCR4拮抗剂）能够重塑肿瘤免疫微环境，产生显著的协同抗肿瘤效应。这一发现不仅深化了对HCC免疫逃逸机制的理解，更为克服PD-1耐药提供了新的治疗靶点和可转化的联合治疗策略。

三、主要技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法：收集59例HCC患者的肿瘤组织和配对癌旁组织进行流式细胞术分析免疫细胞浸润；利用TIMER 3.0平台对TCGA-LIHC队列进行生物信息学分析；从健康志愿者外周血单核细胞中分离CD34⁺祖细胞体外分化培养人肥大细胞（hMCs）；采用Transwell实验评估细胞迁移能力；使用CFSE增殖实验和细胞周期分析检测细胞增殖；运用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测多种细胞因子和趋化因子水平；构建C57BL/6小鼠皮下Hepa1-6 HCC模型和原位HCC模型进行体内药效验证；通过HE染色和Ki67免疫组化染色评估组织病理学特征。

四、研究结果

3.1 MC积聚与HCC进展相关。 通过对59对HCC及癌旁组织的流式细胞术分析，研究人员发现肿瘤组织中MC浸润和Treg浸润比例显著升高，而CD8⁺ T细胞浸润比例显著降低。相关性分析显示，MC浸润与Treg丰度呈显著正相关，与CD8⁺ T细胞丰度呈显著负相关。TCGA-LIHC队列生物信息学分析进一步证实SCF表达与MC浸润正相关。高MC浸润组患者表现出更高的血管侵犯率、淋巴结转移率和CNLC III/IV期比例，提示MC积聚与HCC恶性进展密切相关。

3.2 HCC细胞通过SCF促进MC迁移并维持其增殖。 ELISA检测显示HCC肿瘤组织中SCF水平显著高于癌旁组织，且TAMC浸润密度与SCF浓度呈显著正相关。Transwell实验表明，HCC条件培养基（TCCS）显著促进hMC迁移，而CD117（SCF受体）中和抗体可消除此效应。CFSE增殖实验和细胞周期分析显示，TCCS刺激促进hMC增殖并增加S期细胞比例，CD117阻断则导致G0/G1期阻滞，证实SCF-CD117轴介导了HCC细胞对MC的募集和增殖促进作用。

3.3 TAMC通过分泌趋化因子将Treg募集至肿瘤微环境。 ELISA检测发现，经TCCS刺激的hMC上清液中CCL1、CCL5、CCL17、CCL22和CCL28水平均升高，其中CCL17和CCL22升高最为显著。临床样本证实肿瘤组织中CCL17水平高于癌旁组织，且CCL17浓度与TAMC和Treg浸润密度均呈显著正相关。Transwell共培养实验显示，TCCS预处理的hMC显著增强Treg迁移，而CCR4拮抗剂可消除此效应，表明MC通过CCL17/CCL22-CCR4信号轴部分介导Treg向肿瘤微环境的募集。

3.4 TAMC-Treg轴抑制CD8⁺ T细胞功能。 流式细胞术分析显示，当CD8⁺ T细胞与TCCS活化的TAMC及Treg共培养时，其增殖能力受到抑制，而加入CCR4拮抗剂可显著恢复CD8⁺ T细胞增殖。ELISA检测显示共培养体系中颗粒酶B、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和穿孔素水平均降低，CCR4拮抗剂处理可部分恢复这些效应分子的分泌，证实TAMC募集的Treg具有功能性免疫抑制活性。

3.5 靶向TAMC-趋化因子轴增强抗PD-1在HCC小鼠模型中的疗效。 在皮下Hepa1-6荷瘤小鼠中，抗PD-1单药治疗虽有一定抑瘤效果但肿瘤仍持续生长。抗PD-1联合色甘酸钠或CCR4拮抗剂产生更强的抗肿瘤效应，而三联联合方案（抗PD-1+色甘酸钠+CCR4拮抗剂）几乎完全抑制肿瘤生长，肿瘤体积在第16天后趋于平台期。终点肿瘤重量、HE染色组织学评分和Ki67增殖指数均一致显示三联方案疗效最优。

3.6 联合治疗重塑HCC肿瘤免疫微环境。 流式细胞术分析显示，抗PD-1单药主要扩增CD8⁺ T细胞，对Treg和MC影响有限。抗PD-1联合色甘酸钠特异性降低肿瘤内MC比例，联合CCR4拮抗剂则耗竭Treg。三联方案最大程度抑制MC和Treg，同时显著提升CD8⁺ T细胞比例。ELISA检测显示三联组肿瘤内颗粒酶B和IFN-γ水平显著高于单药或双药组，CCL17在色甘酸钠组和三联组中显著下调。

3.7 原位HCC模型验证三联方案的协同抗肿瘤疗效。 在更贴近生理条件的原位Hepa1-6 HCC模型中，三联方案同样表现出最强的抗肿瘤效果，肿瘤结节最小、肿瘤负荷最低、肝重体重比最低。Ki67染色证实三联组增殖活性最低。流式细胞术分析显示，色甘酸钠组MC比例显著降低，CCR4拮抗剂组Treg浸润减少，三联组CD8⁺ T细胞比例在所有治疗组中最高。ELISA显示三联组颗粒酶B、IFN-γ、TNF-α和穿孔素水平最高，色甘酸钠组CCL17水平显著降低。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，该研究揭示了HCC细胞分泌SCF募集并激活TAMC，活化TAMC通过分泌CCL17以CCR4依赖方式募集Treg，从而抑制CD8⁺ T细胞抗肿瘤功能并导致抗PD-1耐药的完整机制轴。该发现将TAMC-CCL17-CCR4轴确立为克服PD-1耐药和开发有效联合治疗策略的合理靶点。研究同时承认存在若干局限性：临床队列规模较小且为单中心；皮下荷瘤模型不能完全模拟人原位HCC的肿瘤微环境；TAMC中调控CCL17分泌的下游信号通路及TAMC活化亚型的功能异质性尚未探索；联合治疗的临床疗效、最佳给药方案和安全性有待未来临床试验验证。研究结论认为，该工作揭示了TAMC通过CCL17募集Treg驱动HCC免疫抑制微环境和抗PD-1耐药的核心机制，阐明了HCC细胞-SCF-TAMC-CCL17-Treg轴在HCC进展和免疫治疗耐药中的重要作用，同时证明靶向该轴的联合治疗策略可显著增强抗PD-1疗效，为HCC提供了新的治疗靶点和可临床转化的联合治疗方案。