甜菜碱经WNT4/mTOR信号通路调控反应性星形胶质细胞增生与突触完整性以减轻铜腙诱导的皮质脱髓鞘

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Betaine Attenuates Cuprizone-Induced Cortical Demyelination: The Role of the WNT4/mTOR Signalling Pathway in Regulating Astrogliosis and Synaptic Integrity

　　

皮质灰质（cortical grey matter）病理改变在脱髓鞘疾病早期即出现，并且是永久性神经功能损害的主要驱动因素。研究人员开展的这项研究探讨了甜菜碱（betaine, BET）对铜腙（cuprizone, CPZ）诱导的大鼠大脑皮质损伤的神经保护作用，重点分析其调控上游WNT4（WNT family member 4, WNT4）/mTOR（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号通路的能力。收集皮质组织进行氧化和炎症标志物的生化评估、WNT4、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）和mTOR基因表达的实时PCR分析、组织病理学检查，以及波形蛋白（vimentin）、S100（S100 calcium-binding protein）和突触素（synaptophysin）的免疫组化分析。暴露于CPZ导致严重皮质损伤并伴显著氧化应激。该氧化状态触发明显的神经炎症反应，导致白细胞介素-17A（interleukin-17A, IL-17A）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-alpha, TNF-α）水平升高，进而引起慢性、高反应性星形胶质细胞增生（astrogliosis）。GFAP基因表达上调以及波形蛋白和S100β（S100 calcium-binding protein beta, S100β）免疫组化染色增强证实了这一点，并导致皮质突触完整性广泛丧失（突触素耗竭）。重要的是，甜菜碱治疗发挥分子制动作用，显著下调WNT4和mTOR的异常基因表达。这种靶向下调有效减少过度活跃的胶质反应，显著减轻星形胶质细胞增生（GFAP、波形蛋白和S100β），缓解促炎细胞因子，恢复内源性抗氧化功能，并最终保留皮质突触素表达和细胞结构。总体而言，这些结果表明甜菜碱对CPZ诱导的皮质损伤发挥神经保护作用，这与减弱WNT4/mTOR信号通路过度激活、抑制星形胶质细胞增生和保留突触密度密切相关。保留皮质灰质完整性直接与减轻多发性硬化（multiple sclerosis, MS）患者的认知缺陷和长期身体残疾相关，强调了可靶向神经保护疗法的转化相关性。

研究背景方面，多发性硬化（multiple sclerosis, MS）等中枢神经系统（central nervous system, CNS）脱髓鞘疾病由神经炎症、氧化应激和胶质功能障碍共同驱动，导致进行性神经功能下降。既有研究长期聚焦白质（white matter, WM）病理，但临床与影像学证据提示皮质灰质（grey matter, GM）脱髓鞘和萎缩在疾病早期即出现，可独立于白质病灶活动，并是长期身体残疾和认知下降的主要来源。传统疾病修饰治疗主要针对外周白细胞向白质迁移，对皮质灰质损伤的神经保护策略仍不足。铜腙（cuprizone, CPZ）模型虽常用于模拟MS样病理，但多数研究集中于胼胝体等白质结构，CPZ所致皮质灰质损伤的具体病理过程及靶向保护治疗研究不足。分子层面，WNT4（WNT family member 4, WNT4）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信号轴与反应性星形胶质细胞增生、代谢重编程和神经炎症相关；甜菜碱（betaine, BET）具有抗氧化、抗炎和神经保护潜能，但其对CPZ诱导皮质灰质损伤的作用尚未被探索。因此，研究人员评估BET对CPZ诱导大鼠皮质损伤的神经保护作用，并聚焦WNT4/mTOR介导的星形胶质细胞增生与突触完整性。研究采用成年雄性Wistar大鼠CPZ模型，比较BET预防性与治疗性给药，结果显示BET可减轻皮质氧化应激、神经炎症和星形胶质细胞增生，下调WNT4、mTOR和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达，并保留突触素（synaptophysin）表达和皮质组织架构；其结果将研究焦点从白质转向皮质灰质，为BET作为灰质神经保护候选提供了多层面证据，并提示早期干预的重要性。

关键技术方法概括（不超过250字）：实验动物为40只成年雄性Wistar大鼠（2–3月龄，150–170 g），来源于埃及Alexandria University医学院动物设施；随机分为对照、BET、CPZ、预防性BET+CPZ和治疗性CPZ+BET五组（每组n=8）。采用改良双相口服灌胃CPZ造模，BET经口给药3周。皮质组织分为组织学（n=3）和生化/分子（n=5）亚组。生化检测丙二醛（malondialdehyde, MDA）、一氧化氮（nitric oxide, NO）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）及IL-17A、IL-1β、TNF-α；实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测WNT4、GFAP、mTOR（β-actin为内参，2^?ΔΔCt法计算）；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色评估组织病理；免疫组化检测S100β、波形蛋白和突触素，并结合图像定量与统计相关分析。

结果部分保留原文小标题并浓缩如下。3.1 BET Ameliorates CPZ-Induced Oxidative Stress in the Cerebral Cortex（BET改善CPZ诱导的皮质氧化应激）：通过皮质生化检测发现，CPZ显著升高MDA和NO、降低GSH并抑制CAT和SOD活性；BET预防组和治疗组均显著降低脂质过氧化与亚硝化应激，恢复GSH及抗氧化酶活性，且预防组更明显。3.2 BET Suppresses CPZ-Induced Pro-Inflammatory Cytokine Levels（BET抑制CPZ诱导的促炎细胞因子水平）：通过检测IL-17A、IL-1β和TNF-α发现，CPZ诱导强烈神经炎症反应，BET预防和治疗均显著降低这些促炎因子，预防组接近对照水平。3.3 BET Mitigates CPZ-Induced Transcriptional Activation of Gliosis-Related Markers（BET减轻CPZ诱导的胶质增生相关标志物转录激活）：通过qRT-PCR发现CPZ上调mTOR、WNT4和GFAP mRNA表达，BET显著下调其表达，预防组接近基线；Pearson相关分析显示WNT4/mTOR、mTOR/GFAP及WNT4/GFAP表达呈强正相关。3.4 BET Attenuates CPZ-Induced Demyelination and Preserves Cortical Histoarchitecture（BET减轻CPZ诱导的脱髓鞘并保留皮质组织架构）：H&E染色显示CPZ组出现神经元胞体皱缩、胞质嗜酸性、核固缩、神经毡空泡化及血管扩张充血等严重皮质损伤；BET组显著减少空泡化和固缩退化神经元，保留较多完整神经元，预防与治疗组均有改善并可见轻度局灶性改变。3.5 BET Attenuates CPZ-Induced Astrogliosis and Synaptic Loss in the Cerebral Cortex（BET减轻CPZ诱导的皮质星形胶质细胞增生与突触丢失）：3.5.1 Astroglial Activation and Reactive Gliosis (S100β, and Vimentin)（星形胶质细胞激活与反应性胶质增生）：免疫组化显示CPZ组S100β和波形蛋白强阳性、星形胶质细胞胞体肥大且突起致密延长；BET组染色强度降低、细胞肥大减轻，预防组更接近正常，定量阳性面积百分比支持该结论。3.5.2 Synaptic Integrity (Synaptophysin)（突触完整性）：免疫组化显示CPZ组突触素免疫染色显著降低，BET组显著恢复突触素表达，预防组接近对照且优于治疗组，定量阳性面积百分比支持BET保护突触密度。

讨论部分总结认为，BET对CPZ诱导的皮质脱髓鞘发挥多层面神经保护和胶质保护作用；将研究重点从经典白质束转向大脑皮质，回应了灰质病理与MS永久残疾和认知下降相关的临床缺口。讨论将CPZ所致铜螯合、Cu²⁺依赖性酶抑制、氧化/亚硝化应激、促炎细胞因子释放、WNT4/mTOR过度激活、GFAP/波形蛋白/S100β上调及突触素丢失联系起来，指出BET作为“分子刹车”下调WNT4和mTOR，减少反应性星形胶质细胞增生，恢复抗氧化防御并保留皮质突触结构。讨论还从一碳代谢中甲基供体、betaine-homocysteine S-methyltransferase（BHMT）促进同型半胱氨酸转化、S-adenosylmethionine（SAM）补充、SAMTOR营养感应、Akt/GSK-3β-TSC1/2-Rheb-mTORC1轴及有机渗透质作用等方面解释BET的多模式机制，并强调预防性给药优于治疗性给药，提示在级联反应自持前早期干预更有利于保留皮质结构。临床转化部分提到大鼠1 g/kg/day剂量按体表面积换算约相当于人 equivalent dose（HED）162 mg/kg/day，对70 kg成人约11.3 g/day，与FDA和EMA批准的6–9 g/day甜菜碱 anhydrous临床范围接近；BET可经betaine/GABA transporter（BGT-1）通过血脑屏障，作为口服、非免疫抑制的神经保护辅助策略具有潜力。局限包括仅使用雄性大鼠、3周观察期主要反映急性/亚急性损伤、未进行行为学测试、未进行电镜髓鞘g-ratio等直接再髓鞘指标、以及仅依赖qPCR转录分析而缺乏WNT4和mTOR的Western blot验证。研究结论译述为：本研究表明BET对CPZ诱导的大脑皮质细胞毒性具有强效神经保护和胶质保护作用；皮质灰质损伤由紧密同步的致病机制驱动，CPZ诱导的氧化和亚硝化应激导致WNT4和mTOR表达同步上调，该高活跃分子微环境与GFAP介导的显著反应性星形胶质细胞增生、结构中间丝S100β和波形蛋白改变及促炎细胞因子释放直接相关，造成广泛皮质突触变性和突触素显著丢失；研究资料表明BET给药尤其是预防性方案可有效保留皮质灰质完整性和突触标志物表达，该保护表型与WNT4/mTOR轴的通路调节作用及胶质反应性降低一致，为脱髓鞘疾病灰质病理提供了有前景的非侵入性治疗候选；这一分子变化直接转化为皮质微结构保留和突触密度恢复；总体而言，研究结果突出BET减轻皮质病灶的潜在保护和治疗作用，并强调MS等神经炎症和脱髓鞘疾病有效管理的关键临床窗口。