《MicrobiologyOpen》：Genomic Landscape Underlying Biofilm Formation Diversity in Nakaseomyces glabratus Clinical Isolates
编辑推荐：
生物膜形成（biofilm formation）是真菌感染持续性和致病性的关键决定因素，但临床分离株间该表型变异性的遗传基础仍知之甚少。本研究分析了95株N. glabratus临床分离株的生物膜形成能力，揭示出较大的表型多样性。值得注意的是，尿路相关分离株平
生物膜形成（biofilm formation）是真菌感染持续性和致病性的关键决定因素，但临床分离株间该表型变异性的遗传基础仍知之甚少。本研究分析了95株N. glabratus临床分离株的生物膜形成能力，揭示出较大的表型多样性。值得注意的是，尿路相关分离株平均产生的生物膜约为其余分离株的两倍。研究人员进一步聚焦于3株最低和4株最高生物膜产生分离株进行深入分析。较高的总生物膜质量与较高的代谢活性（metabolic activity）及碳水化合物胞外基质（extracellular matrix, ECM）含量持续相关，而与针对Galleria mellonella感染模型的毒力未见相关性。对这些高、低生物膜产生菌株进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），得到184个其突变可能构成生物膜形成变异性基础的基因。对其中24个基因进行缺失，鉴定出BST1、EST3、LSM7、AMS1和ZCF21为此前未表征的生物膜形成贡献因子，其破坏导致可测量的生物膜生物量降低。总之，所获知识提示尿路中宿主内正选择，有利于N. glabratus向生物膜生长特化。新生物膜形成效应因子的鉴定与生物膜发育中连接转录调控和细胞表面结构的多层网络（multi-layered network）的存在相一致。
Nakaseomyces glabratus（原Candida glabrata）是念珠菌病第二常见病原，其生物膜（biofilm）与持续感染和致病性密切相关。既往研究提示，该物种向较强生物膜形成的特化与其分支中致病生活方式的出现存在系统发育相关性；与近缘非致病种的主要遗传差异集中于细胞壁组织和黏附基因家族扩张，尤其是亚端粒区域编码的EPA家族。临床菌株基因组研究已涉及毒力、耐药及宿主内微进化，且宿主内进化常表现为细胞壁蛋白和黏附素基因非同义突变（non-synonymous mutation）富集。然而，临床分离株间生物膜形成变异性的遗传基础仍不清楚；其他Candida物种中观察到的分离部位与生物膜形成关联在N. glabratus中未获验证；虽已建立生物膜起始与哺乳动物尿路定植之间的调控联系，但N. glabratus中该生态环境与生物膜形成变异相关的证据仍缺乏。因此，研究人员对临床分离株生物膜形成多样性及其遗传基础开展研究。
研究人员分析了来自葡萄牙Hospital of Santa Maria（HSM, Lisboa）和Centro Hospitalar S?o Jo?o（CHSJ, Porto）的95株N. glabratus临床分离株，发现生物膜形成能力存在显著表型多样性；尿路相关分离株平均生物膜产量约为其他分离株的两倍；高生物膜产生与较高代谢活性和碳水化合物ECM含量相关，而与Galleria mellonella感染模型毒力和人上皮黏附无一致性相关；比较基因组分析得到184个候选基因，24个基因缺失验证鉴定出BST1、EST3、LSM7、AMS1和ZCF21为新的生物膜形成贡献因子。该研究提示尿路中可能存在宿主内正选择，并支持N. glabratus生物膜形成由连接转录调控与细胞表面结构的多层网络驱动，对理解其持续感染和生态适应具有重要意义。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员使用上述95株N. glabratus临床分离株队列，以结晶紫法在聚苯乙烯板定量生物膜，并选取4株高产生和3株低产生分离株深入比较；测定ECM多糖与蛋白、代谢活性、细胞活力、VK2/E6E7人阴道上皮细胞黏附及Galleria mellonella感染模型毒力；对7株进行WGS，以CBS138为参考进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）注释和功能效应预测；在KUE-100背景构建24个候选基因单缺失突变体，以结晶紫法验证生物膜表型，并用生长曲线排除生长缺陷。
3.1 N. glabratus Clinical Isolates Harbor Great Biofilm Formation Diversity（N. glabratus临床分离株具有高度的生物膜形成多样性）：通过结晶紫法筛选95株临床分离株，发现大多数分离株（53%）生物膜产量很低，少数（3%）接近方法饱和水平；生物膜形成能力与年龄、性别及唑类药物MIC
50无关；尿路相关分离株平均生物膜总质量约为其他解剖部位分离株的两倍，10株最强产生株中7株来自尿液样本，尿路分离株平均值较其他样本高1.72倍，单尾Welch t检验p=0.016。
3.2 Higher Biofilm Production Correlates With Higher Polysaccharide Content in the ECM（较高生物膜产量与ECM中较高多糖含量相关）：通过比较4株高产生和3株低产生分离株，发现较高总生物膜质量与较高代谢活性及碳水化合物ECM含量一致相关；强产生株碳水平均浓度为42.1 mg/L，弱产生株为32.1 mg/L，差异显著（p<0.001，单尾Welch t检验）；强产生株平均代谢活性为弱产生株的2.9倍（p<0.005）；未发现生物膜形成能力与细胞活力、可溶性或不溶性蛋白含量显著相关，提示强生物膜表型主要由生物膜相关细胞数量增加及碳水化合物合成和分泌驱动。
3.3 Biofilm Production Capacity Does Not Correlate With Virulence or Adherence to Human Epithelial Cells（生物膜产生能力与毒力或人上皮细胞黏附不相关）：通过Galleria mellonella感染模型评估致死性，强产生株72 h致死率为53%–97%，弱产生株为60%–85%，平均分别为77%和70%，log-rank检验未显示显著差异；通过VK2/E6E7人阴道上皮细胞黏附试验，多数分离株黏附率为20%–50%，强产生株56,067黏附率超过80%，但该特征未在其他强产生株中保持一致，说明生物膜形成与上皮黏附为不同但可能互补的持续存在相关性状。
3.4 Genomic Diversity Underlying Biofilm Formation Capacity（生物膜形成能力背后的基因组多样性）：通过对4株高产生和3株低产生分离株进行WGS并与CBS138参考株比较，发现4株高产生株共享2660个常见SNP，其中仅10%为转录区非同义突变；严格筛选仅发现2个仅存在于所有高产生株的非同义SNP；放宽策略A得到38个基因，策略B得到146个基因，共形成184个候选基因；黏附素为最常见功能类别，EPA、AWP和PWP家族多个黏附素基因携带非同义SNP，TEC1突变仅见于高生物膜产生株，与既往将TEC1界定为N. glabratus生物膜形成关键调控因子的结果一致。
3.5 Identification of New Biofilm Formation Effectors Among Genes With Specific SNPs in High Biofilm Producing Strains（高生物膜产生株特异性SNP基因中新生物膜形成效应因子的鉴定）：从184个候选基因中选择24个SNP频率较高且此前未与生物膜表型关联的基因，在KUE-100背景构建单缺失突变体并以结晶紫法验证；结果显示BST1、EST3、LSM7、AMS1和ZCF21为最大生物膜形成所需，其缺失导致生物膜生物量可测量降低；生长曲线显示亲本株与Δams1、Δest3、Δlsm7、Δbst1、Δzcf21突变体在24 h时几乎不可区分，排除了生长缺陷作为主要解释。
讨论部分总结：本研究支持N. glabratus生物膜形成具有多基因、多通路架构，而非由单一主导因子决定；尿路分离株中强生物膜产生株富集提示尿路环境可能施加有利于生物膜相关性状的选择压力，导管等惰性表面及流体剪切、吞噬和可溶性抗菌成分耐受等生存优势可能有利于该生态位定植；生物膜形成与毒力及上皮黏附的解离提示其可能主要通过持续存在、环境耐受或治疗耐受而非增强初始宿主细胞附着来贡献致病性；黏附素基因虽在候选突变位点中占比较高，但因位于高度动态的亚端粒区域而未进一步分析；24个候选基因缺失验证发现的新贡献因子涉及细胞壁组织、转录和转录后调控及基因组稳定性，支持生物膜形成依赖整合细胞表面结构与基因表达控制的多层网络，并与SIR复合体介导的亚端粒沉默调控可能一致，EST3还提示端粒维持与亚端粒基因调控之间存在联系。
研究结论翻译：总体而言，本研究支持如下模型：N. glabratus的生物膜形成源于多个调控层的整合，包括染色质组织、基因表达控制和细胞表面结构。BST1、EST3、LSM7、AMS1和ZCF21等新贡献者的鉴定拓展了当前对该网络的认识，并强调非经典通路在塑造生物膜表型中的重要性。这些发现进一步提示，宿主内演化，尤其尿路中的演化，可能创造有利条件，使与增强生物膜形成相关的遗传变异通过多样且相互关联的机制反复出现。
