整合scRNA-seq与scATAC-seq揭示lncRNA RP11-661C8.2通过促进上皮-间质转化参与透明细胞肾细胞癌进展

《Molecular Carcinogenesis》：Integration of scRNA-Seq and scATAC-Seq Revealed the Role of lncRNA RP11-661C8.2 by Promoting EMT in Clear Cell Renal Cell Carcinoma

长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤进展中发挥重要作用。然而，既往发现的多数促进或抑制肿瘤进展的lncRNA来源于bulk RNA-seq结果。研究人员整合了透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞转座酶可及性染色质测序（scATAC-seq）数据，以精准识别调控ccRCC肿瘤进展的lncRNA。研究人员分析了23例ccRCC样本的scRNA-seq数据和19例样本的scATAC-seq数据，分别捕获了121,106个细胞的转录组和61,693个细胞的表观遗传特征。结果显示，通过scATAC-seq发现lncRNA RP11-661C8.2与ccRCC肿瘤细胞中显著的染色质可及性相关。随后，整合scRNA-seq分析以及体外和体内功能实验证实了RP11-661C8.2在促进ccRCC细胞侵袭、迁移和上皮-间质转化（EMT）中的作用。此外，RP11-661C8.2在上调ITGAV和激活PI3K/AKT信号通路中发挥作用，这可能是其促进ccRCC细胞EMT的潜在机制。该研究鉴定了RP11-661C8.2在ccRCC中的作用，为ccRCC提供了新的参考依据和潜在干预靶点。

研究背景：肾细胞癌（RCC）起源于肾小管上皮细胞，是泌尿系统常见恶性肿瘤；中国2024年新发48,894例，美国80,980例，且发病率逐年增加。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）约占原发性RCC的80%，为最常见组织学亚型。早期局限性ccRCC经手术治疗可获得较好预后，但约三分之一患者术后仍发生肿瘤复发或转移，显著影响生存率与生活质量，因此ccRCC发病机制研究具有紧迫性。ccRCC具有高度异质性和遗传易感性，已知机制主要涉及两条关键通路：VHL突变编码肿瘤抑制因子pVHL并构成E3泛素连接酶复合物重要组分；另一条为PI3K/AKT/mTOR信号通路，其激活上调血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子α（TGFA），诱导血管生成并促进肿瘤细胞生长。然而，VEGF及其受体家族的调控机制尚未完全阐明。近期研究发现非编码RNA在多种癌症发生发展中起关键作用，尤其是约占人类转录组68%的lncRNA。既往研究显示lncRNA LUCAT1可通过调控microRNA-375/YAP1轴、激活AKT/GSK-3β信号通路及负调控miR-495-3p促进ccRCC进展；lncRNA SNHG12可通过上调CDCA3促进ccRCC肿瘤进展和靶向药物耐药。但既往研究多从bulk RNA-seq发现lncRNA调控ccRCC的线索，属于ccRCC组织整体水平的结果，仍需在单细胞水平更精准深入地解析其机制。scRNA-seq可在单细胞水平发现肿瘤异质性特征，整合scATAC-seq可精确揭示肿瘤细胞中染色质调控基因表达的特征，尤其可捕获非编码区染色质可及性状态，包括lncRNA的表观遗传调控特征。基于此，研究人员整合既往ccRCC的scRNA-seq与scATAC-seq数据，确定lncRNA RP11-661C8.2在促进ccRCC细胞侵袭、迁移和EMT中的作用，为研究ccRCC进展机制提供新的参考。

研究人员开展的工作与意义：研究人员整合23例ccRCC样本的scRNA-seq数据和19例样本的scATAC-seq数据，分别捕获121,106个细胞转录组与61,693个细胞表观遗传特征；通过scATAC-seq发现RP11-661C8.2在ccRCC肿瘤细胞中具有显著染色质可及性，随后整合scRNA-seq分析及体外、体内功能实验证实其促进ccRCC细胞侵袭、迁移和EMT；进一步发现RP11-661C8.2上调ITGAV并激活PI3K/AKT信号通路，可能是促进ccRCC细胞EMT的潜在机制。该研究鉴定了RP11-661C8.2在ccRCC中的作用，为ccRCC提供新的参考依据和潜在干预靶点。

关键技术与方法：研究人员整合GEO来源的ccRCC scRNA-seq数据（23例；GSE207493、GSE152938、GSE171306）与scATAC-seq数据（19例；GSE207493），采用Seurat、DoubletFinder、Harmony和Signac进行质控、降维聚类、细胞分型及染色质可及性分析；结合蛋白质质谱（MS）筛选RP11-661C8.2互作蛋白并行基因本体（GO）富集；以反义寡核苷酸（ASO）和慢病毒过表达构建RP11-661C8.2/ITGAV调控细胞模型，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）、划痕愈合、Transwell、蛋白质印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）及裸鼠皮下成瘤模型进行体外和体内验证；以MK-2206抑制AKT。

研究结果：
3.1 scATAC-seq显示lncRNA RP11-661C8.2在ccRCC中具有肿瘤细胞特异性表观遗传和转录特征。研究人员分析19例ccRCC scATAC-seq数据，统一流形近似与投影（UMAP）显示肿瘤与非肿瘤细胞聚类差异；恶性细胞进一步分为16个ccRCC亚群（ccRCC 1–16）；非恶性细胞注释为自然杀伤T（NKT）细胞、CD4⁺ T细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞（CAFs 1和2）、NK细胞、B细胞、CDC37⁺细胞、SHCBP1⁺细胞和CD56⁺ NK细胞。scATAC-seq鉴定出23个在肿瘤细胞中具有显著染色质可及性的lncRNA，其中RP11-661C8.2最显著；其位点在肿瘤细胞簇中染色质可及性明显升高，而在免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞等非恶性细胞中最低或检测不到；RT-qPCR显示RP11-661C8.2在ccRCC组织（n=20）中较癌旁正常肾组织（n=20）显著升高，肿瘤样本表达更高且样本间变异更大，提示其具有肿瘤细胞特异性染色质可及性，可能是表观遗传失调驱动的ccRCC特异性致癌lncRNA。
3.2 整合scRNA-seq与蛋白MS揭示RP11-661C8.2促进EMT的潜在生物学功能。研究人员分析23例ccRCC scRNA-seq数据，鉴定23个细胞簇，包括4个ccRCC亚群（ccRCC 1–4）、免疫细胞亚群、内皮细胞（Endo 1–3）、CAFs和成纤维细胞，并基于差异表达基因（DEGs）定义细胞类型。蛋白MS显示RP11-661C8.2与多种细胞骨架和马达蛋白物理互作，包括TPM1、TPM3、MYL6、MYH9、ACTG1、ACTB和TPM4；这些蛋白为肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置关键组分，调控细胞形态、运动和机械转导，与EMT相关。该共表达特征主要富集于间充质细胞群（内皮细胞和CAFs），CAFs和内皮细胞高表达互作蛋白，CAFs中MYH9、MYL6、ACTB和TPM家族表达尤其强。GO富集分析显示RP11-661C8.2相关基因富集于骨骼肌原纤维组装、骨骼肌细丝组装、突触后肌动蛋白细胞骨架组织和间充质迁移等过程，支持其在协调细胞可塑性和转录后调控中的作用；多组学分析提示RP11-661C8.2可能通过与关键细胞骨架组分互作促进ccRCC的EMT。
3.3 RP11-661C8.2在体外和体内促进ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭。研究人员用ASO在OS-RC-2细胞中进行功能缺失研究，RT-qPCR证实ASO1和ASO2显著降低RP11-661C8.2表达；CCK-8显示敲低显著抑制48 h内OS-RC-2细胞增殖；EdU掺入实验显示EdU阳性增殖细胞比例明显降低；划痕愈合实验显示敲低组在24 h和48 h伤口闭合能力显著受损；Transwell侵袭实验显示侵袭细胞数显著减少；WB显示敲低后E-cadherin上调、N-cadherin下调，支持RP11-661C8.2促进EMT。异种移植模型中，RP11-661C8.2敲低组肿瘤生长受抑，实验终点肿瘤体积显著小于对照组。随后构建RP11-661C8.2过表达OS-RC-2细胞，EdU阳性增殖细胞比例显著增加，24 h划痕修复能力增强，Transwell侵袭和迁移细胞数增加；过表达组裸鼠皮下成瘤20天后肿瘤体积和重量显著大于对照组。结果证实RP11-661C8.2促进ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭。
3.4 RP11-661C8.2调控整合素亚基αV ITGAV。考虑到VEGF与受体结合可导致ccRCC增殖、侵袭和迁移，且RP11-661C8.2亦促进这些表型，研究人员检测VEGF及其互作受体。RT-qPCR显示RP11-661C8.2敲低后VEGFA、VEGFB、ITGB1、NRP1和ITGAV mRNA水平显著降低；WB显示仅ITGAV蛋白水平显著变化。研究聚焦ITGAV（整合素亚基αV，与肿瘤发生发展及不良预后相关），发现两个独立ccRCC细胞系中RP11-661C8.2敲低对ITGAV表达影响一致，提示二者存在正调控关系；RP11-661C8.2过表达显著增加OS-RC-2细胞ITGAV蛋白丰度，提示其在转录和翻译水平调控ITGAV。异种移植肿瘤中，RT-qPCR显示RP11-661C8.2敲低显著抑制ITGAV表达，WB显示ITGAV蛋白水平明显降低，IHC显示敲低组ITGAV表达显著下降；体外和体内结果结合表明RP11-661C8.2上调ITGAV，ITGAV可作为其促进EMT的下游靶点。
3.5 ITGAV促进ccRCC细胞增殖、EMT及PI3K/AKT信号通路激活。研究人员构建ITGAV过表达慢病毒并转导ccRCC细胞，RT-qPCR证实786-O和OS-RC-2细胞中ITGAV过表达；CCK-8显示ITGAV过表达显著增强786-O和OS-RC-2细胞增殖能力；EdU实验显示EdU阳性增殖细胞比例增加；Transwell实验显示ITGAV过表达显著增强786-O和OS-RC-2细胞迁移和侵袭能力；WB显示ITGAV过表达下调E-cadherin、上调N-cadherin，促进EMT；WB显示ITGAV过表达增加磷酸化AKT（p-AKT）水平及p-AKT/AKT比值，提示激活PI3K/AKT信号通路。在RP11-661C8.2敲低细胞中过表达ITGAV（ITGAV-OE+ASO）后，与ITGAV-OE组相比，细胞增殖显著下降，Transwell迁移和侵袭能力下降；WB显示ITGAV-OE促进EMT，而同时敲低RP11-661C8.2显著削弱ITGAV诱导的EMT。用AKT抑制剂处理ITGAV-OE细胞后，ITGAV-OE增加的p-AKT激活被逆转；RP11-661C8.2敲低亦导致p-AKT激活降低，支持RP11-661C8.2调控ITGAV与PI3K/AKT信号网络。结果表明ITGAV过表达所致增殖、迁移、侵袭和EMT表型反映RP11-661C8.2对ITGAV的调控，PI3K/AKT信号通路激活可能是促进ccRCC细胞EMT的潜在机制。

讨论总结：该研究通过整合单细胞多组学分析和功能实验，系统阐明lncRNA RP11-661C8.2在ccRCC中促进侵袭、迁移和EMT的作用。RP11-661C8.2在ccRCC中呈严格肿瘤细胞特异性表达模式，其特异性源于该位点在恶性细胞中的特定染色质开放状态，并在16个ccRCC细胞亚群中显示显著特异性染色质可及性。RP11-661C8.2与细胞骨架蛋白（TPM1、TPM3、MYL6、MYH9、ACTG1、ACTB和TPM4）的物理互作提示其可能作为分子支架调控肌动蛋白-肌球蛋白收缩装置，这与GO富集中“间充质迁移”通路显著富集一致，提示其可能通过机械转导机制促进肿瘤细胞形态重塑和运动能力获得。scATAC-seq有助于发现单细胞或细胞亚型水平的肿瘤表观遗传特征，scRNA-seq可提供肿瘤转录组特征；整合二者可解释表观遗传调控如何指导转录，是揭示肿瘤表观遗传调控的潜在新方法。ITGAV是该研究识别的关键下游效应分子，既往研究显示其在胃癌、食管腺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和结直肠癌等肿瘤进展或预后中发挥重要作用；ccRCC中ITGAV的生物学效应研究仍有限，RP11-661C8.2可调控ITGAV并以ITGAV作为下游重要靶点。该研究未完全证明RP11-661C8.2调控ITGAV的具体机制；lncRNA亦可调控转录因子、作用于启动子、抑制RNA聚合酶II、吸附miRNA作为海绵等，未来需进一步研究其分子机制。与既往研究类似，该研究进一步证实ITGAV驱动ccRCC细胞增殖、迁移和EMT，同时激活PI3K/AKT信号通路，符合整合素信号转导经典模型；ITGAV-β₃/β₅异二聚体可直接或间接招募PI3K调节亚基p85，并通过AKT磷酸化调控细胞增殖；PI3K/AKT信号通路是ccRCC发生发展的重要通路。该研究鉴定RP11-661C8.2可上调ITGAV并激活PI3K/AKT信号通路，可能是促进ccRCC细胞EMT的潜在机制。局限性包括：RP11-661C8.2与ITGAV的调控关系已识别，但其潜在分子机制及ITGAV精确因果作用仍待进一步验证；PI3K/AKT信号通路激活的层级关系及与其他信号通路的交叉对话仍需超越磷酸化水平检测的深入研究。

研究结论（翻译）：通过单细胞多组学分析和功能验证实验，该研究鉴定了lncRNA RP11-661C8.2在ccRCC中的作用，其促进侵袭、迁移和EMT。此外，RP11-661C8.2在上调ITGAV和激活PI3K/AKT信号通路中发挥作用，这可能是促进ccRCC细胞EMT的潜在机制。这些发现应为ccRCC提供新的参考和潜在干预靶点。